正在做流式實(shí)驗(yàn)的進(jìn)來了解一下！
01、流式的染色條件？一般推薦室溫避光染色20分鐘，或4℃染色30分鐘。具體請(qǐng)參照抗體說明書。
02、流式抗體偶聯(lián)熒光素的方式？
包括直接標(biāo)記和間接標(biāo)記兩種。在條件允許的范圍內(nèi)，盡量用直接標(biāo)記的抗體。如果選擇了間接標(biāo)記的抗體，一抗是純化的抗人的一抗，那么用純化的一抗和熒光標(biāo)記的二抗。如：一抗是小鼠源的抗人的單克隆抗體，二抗則選抗小鼠的二抗（山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均可）。胞內(nèi)因子染色，用直接標(biāo)記熒光染料的抗體。
03、如果檢測(cè)的指標(biāo)數(shù)目超過了流式細(xì)胞儀的通道，怎么辦？
如果需要做5個(gè)指標(biāo)，而流式細(xì)胞儀只能做4個(gè)通道，可以將指標(biāo)歸成2類，再將樣本分成2份，分別檢測(cè)。比如需要同時(shí)檢測(cè)CD3/CD4/CD8/IL-4/IFN-γ，那么將樣本分成兩份，第1份加CD3/CD4/CD8/IL-4，而第2份加CD3/CD4/CD8/IFN-γ。
04、什么是同型對(duì)照？和FMO區(qū)別是什么？
同型對(duì)照：用于確定抗體非特異性結(jié)合到細(xì)胞表面而產(chǎn)生的背景染色，主要是考慮了細(xì)胞的自發(fā)熒光、Fc受體介導(dǎo)的非特異性結(jié)合等因素。對(duì)流式不是非常熟悉，做流式胞內(nèi)實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)指標(biāo)的特異性不高等幾種情況下，必須搭配同型對(duì)照。
熒光扣除對(duì)照(Fluorescence Minus One, FMO):又稱染色缺一對(duì)照，在抗原表達(dá)弱或者多色實(shí)驗(yàn)時(shí)（＞4色）使用，可以反映抗體組合中其他通道熒光的滲漏，確定陽(yáng)性細(xì)胞的閾值，可作為設(shè)門的依據(jù)。
05、如何選擇同型對(duì)照？
與染色的單克隆抗體：
1）相同種屬來源
2）相同免疫球蛋白及亞型
3）相同熒光素標(biāo)記
4）相同劑量和濃度
5）zui-好來自于同一家公司
06、流式設(shè)門要考慮哪些因素？
排除細(xì)胞碎片；進(jìn)行死活鑒定；應(yīng)用合適的陰性對(duì)照；分群不明顯的，根據(jù)同型對(duì)照和FMO圈出陽(yáng)性比例；查閱文獻(xiàn)了解陽(yáng)性比例。
07、Fc受體封閉
單核細(xì)胞、B細(xì)胞、DC細(xì)胞、NK、巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等高表達(dá) FcR，在檢測(cè)這些細(xì)胞時(shí)，會(huì)與抗體的Fc段非特異性結(jié)合，產(chǎn)生假陽(yáng)性信號(hào)。因此，流式檢測(cè)這些細(xì)胞時(shí)，推薦使用相應(yīng)物種的血清或者商品化的Fc受體封閉劑。
08、7AAD單染管調(diào)節(jié)補(bǔ)償，如何猝死細(xì)胞？
一般是加熱65℃處理一分鐘。
09、流式抗體可以做免疫熒光嗎？
理論上是可以的。抗體的濃度需要自己去摸索，以流式抗體的用量為參考。對(duì)于表達(dá)弱的抗原，抗體標(biāo)記的熒光強(qiáng)度不夠，需要選擇熒光強(qiáng)度高的染料。直接標(biāo)記的流式抗體容易淬滅，建議染色后馬上在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。
10、什么是補(bǔ)償微球？
由于熒光光譜的重疊現(xiàn)象，在進(jìn)行流式多色分析時(shí)，必須設(shè)置單染管進(jìn)行熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)。對(duì)于初學(xué)者來說，補(bǔ)償調(diào)節(jié)是流式細(xì)胞術(shù)中比較難掌握的操作，尤其是遇到一些不太常見的指標(biāo)，需要經(jīng)驗(yàn)豐富的流式操作者根據(jù)多年的經(jīng)驗(yàn)判斷來調(diào)節(jié)補(bǔ)償，才可以得到比較好的數(shù)據(jù)。
補(bǔ)償微球大小和淋巴細(xì)胞相當(dāng)，可連接各種熒光標(biāo)記的抗體來調(diào)節(jié)補(bǔ)償。可以像待測(cè)的樣本細(xì)胞一樣在相同的實(shí)驗(yàn)條件下固定，破膜等，操作起來簡(jiǎn)單方便，結(jié)果準(zhǔn)確。克服了以往做三色以上的流式分析時(shí)補(bǔ)償難調(diào)，耗費(fèi)樣本（往往用待測(cè)樣本單標(biāo)來進(jìn)行補(bǔ)償調(diào)節(jié)），專業(yè)要求高等缺點(diǎn)。
11、染色指數(shù)是什么？
染色指數(shù)（SI）可用于比較不同熒光染料在流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用中熒光亮度的差異。該值通過使用陽(yáng)性區(qū)域的平均熒光強(qiáng)度（MFI）減去陰性區(qū)域的平均熒光強(qiáng)度得到的差值，再除以兩倍的陰性區(qū)域標(biāo)準(zhǔn)差獲得。染色指數(shù)越大，熒光強(qiáng)度越高。進(jìn)行抗體滴度的時(shí)候，根據(jù)染色指數(shù)來選擇zui-佳的抗體用量。
12、除PI之外，還有哪些常見的核酸染料？
1）7AAD，488nm激光器激發(fā)，用PerCP通道；
2）DAPI，藍(lán)色熒光染料，355和405nm激光器激發(fā)；
3）Hochest33342, 藍(lán)色熒光染料，355nm激光器激發(fā)。
13、胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測(cè)，如何處理細(xì)胞？
細(xì)胞因子必須被誘導(dǎo)分泌才可以用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)到。常用的刺激劑包括PMA、ionomycin、LPS、CD3/CD28，同時(shí)加入莫能菌素和BFA阻斷劑，防止細(xì)胞因子分泌到胞外。刺激劑的種類，濃度和刺激時(shí)間都可以影響細(xì)胞因子分泌的水平。
14、為什么會(huì)產(chǎn)生高背景和噪音？
實(shí)驗(yàn)中有噪音和高背景可能有以下幾個(gè)原因，如PMT電壓設(shè)置不當(dāng)、死細(xì)胞和碎片干擾、熒光信號(hào)的溢漏，細(xì)胞具有較強(qiáng)的自發(fā)熒光等。
15、在單染管調(diào)節(jié)補(bǔ)償時(shí)候，為什么串聯(lián)染料不可以用相同熒光素不同標(biāo)記來替代調(diào)補(bǔ)償？
串聯(lián)染料的抗體光譜不完全相同，會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的補(bǔ)償
02、流式抗體偶聯(lián)熒光素的方式？
包括直接標(biāo)記和間接標(biāo)記兩種。在條件允許的范圍內(nèi)，盡量用直接標(biāo)記的抗體。如果選擇了間接標(biāo)記的抗體，一抗是純化的抗人的一抗，那么用純化的一抗和熒光標(biāo)記的二抗。如：一抗是小鼠源的抗人的單克隆抗體，二抗則選抗小鼠的二抗（山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均可）。胞內(nèi)因子染色，用直接標(biāo)記熒光染料的抗體。
03、如果檢測(cè)的指標(biāo)數(shù)目超過了流式細(xì)胞儀的通道，怎么辦？
如果需要做5個(gè)指標(biāo)，而流式細(xì)胞儀只能做4個(gè)通道，可以將指標(biāo)歸成2類，再將樣本分成2份，分別檢測(cè)。比如需要同時(shí)檢測(cè)CD3/CD4/CD8/IL-4/IFN-γ，那么將樣本分成兩份，第1份加CD3/CD4/CD8/IL-4，而第2份加CD3/CD4/CD8/IFN-γ。
04、什么是同型對(duì)照？和FMO區(qū)別是什么？
同型對(duì)照：用于確定抗體非特異性結(jié)合到細(xì)胞表面而產(chǎn)生的背景染色，主要是考慮了細(xì)胞的自發(fā)熒光、Fc受體介導(dǎo)的非特異性結(jié)合等因素。對(duì)流式不是非常熟悉，做流式胞內(nèi)實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)指標(biāo)的特異性不高等幾種情況下，必須搭配同型對(duì)照。
熒光扣除對(duì)照(Fluorescence Minus One, FMO):又稱染色缺一對(duì)照，在抗原表達(dá)弱或者多色實(shí)驗(yàn)時(shí)（＞4色）使用，可以反映抗體組合中其他通道熒光的滲漏，確定陽(yáng)性細(xì)胞的閾值，可作為設(shè)門的依據(jù)。
05、如何選擇同型對(duì)照？
與染色的單克隆抗體：
1）相同種屬來源
2）相同免疫球蛋白及亞型
3）相同熒光素標(biāo)記
4）相同劑量和濃度
5）zui-好來自于同一家公司
06、流式設(shè)門要考慮哪些因素？
排除細(xì)胞碎片；進(jìn)行死活鑒定；應(yīng)用合適的陰性對(duì)照；分群不明顯的，根據(jù)同型對(duì)照和FMO圈出陽(yáng)性比例；查閱文獻(xiàn)了解陽(yáng)性比例。
07、Fc受體封閉
單核細(xì)胞、B細(xì)胞、DC細(xì)胞、NK、巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等高表達(dá) FcR，在檢測(cè)這些細(xì)胞時(shí)，會(huì)與抗體的Fc段非特異性結(jié)合，產(chǎn)生假陽(yáng)性信號(hào)。因此，流式檢測(cè)這些細(xì)胞時(shí)，推薦使用相應(yīng)物種的血清或者商品化的Fc受體封閉劑。
08、7AAD單染管調(diào)節(jié)補(bǔ)償，如何猝死細(xì)胞？
一般是加熱65℃處理一分鐘。
09、流式抗體可以做免疫熒光嗎？
理論上是可以的。抗體的濃度需要自己去摸索，以流式抗體的用量為參考。對(duì)于表達(dá)弱的抗原，抗體標(biāo)記的熒光強(qiáng)度不夠，需要選擇熒光強(qiáng)度高的染料。直接標(biāo)記的流式抗體容易淬滅，建議染色后馬上在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。
10、什么是補(bǔ)償微球？
由于熒光光譜的重疊現(xiàn)象，在進(jìn)行流式多色分析時(shí)，必須設(shè)置單染管進(jìn)行熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)。對(duì)于初學(xué)者來說，補(bǔ)償調(diào)節(jié)是流式細(xì)胞術(shù)中比較難掌握的操作，尤其是遇到一些不太常見的指標(biāo)，需要經(jīng)驗(yàn)豐富的流式操作者根據(jù)多年的經(jīng)驗(yàn)判斷來調(diào)節(jié)補(bǔ)償，才可以得到比較好的數(shù)據(jù)。
補(bǔ)償微球大小和淋巴細(xì)胞相當(dāng)，可連接各種熒光標(biāo)記的抗體來調(diào)節(jié)補(bǔ)償。可以像待測(cè)的樣本細(xì)胞一樣在相同的實(shí)驗(yàn)條件下固定，破膜等，操作起來簡(jiǎn)單方便，結(jié)果準(zhǔn)確。克服了以往做三色以上的流式分析時(shí)補(bǔ)償難調(diào)，耗費(fèi)樣本（往往用待測(cè)樣本單標(biāo)來進(jìn)行補(bǔ)償調(diào)節(jié)），專業(yè)要求高等缺點(diǎn)。
11、染色指數(shù)是什么？
染色指數(shù)（SI）可用于比較不同熒光染料在流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用中熒光亮度的差異。該值通過使用陽(yáng)性區(qū)域的平均熒光強(qiáng)度（MFI）減去陰性區(qū)域的平均熒光強(qiáng)度得到的差值，再除以兩倍的陰性區(qū)域標(biāo)準(zhǔn)差獲得。染色指數(shù)越大，熒光強(qiáng)度越高。進(jìn)行抗體滴度的時(shí)候，根據(jù)染色指數(shù)來選擇zui-佳的抗體用量。
12、除PI之外，還有哪些常見的核酸染料？
1）7AAD，488nm激光器激發(fā)，用PerCP通道；
2）DAPI，藍(lán)色熒光染料，355和405nm激光器激發(fā)；
3）Hochest33342, 藍(lán)色熒光染料，355nm激光器激發(fā)。
13、胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測(cè)，如何處理細(xì)胞？
細(xì)胞因子必須被誘導(dǎo)分泌才可以用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)到。常用的刺激劑包括PMA、ionomycin、LPS、CD3/CD28，同時(shí)加入莫能菌素和BFA阻斷劑，防止細(xì)胞因子分泌到胞外。刺激劑的種類，濃度和刺激時(shí)間都可以影響細(xì)胞因子分泌的水平。
14、為什么會(huì)產(chǎn)生高背景和噪音？
實(shí)驗(yàn)中有噪音和高背景可能有以下幾個(gè)原因，如PMT電壓設(shè)置不當(dāng)、死細(xì)胞和碎片干擾、熒光信號(hào)的溢漏，細(xì)胞具有較強(qiáng)的自發(fā)熒光等。
15、在單染管調(diào)節(jié)補(bǔ)償時(shí)候，為什么串聯(lián)染料不可以用相同熒光素不同標(biāo)記來替代調(diào)補(bǔ)償？
串聯(lián)染料的抗體光譜不完全相同，會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的補(bǔ)償
