蛋白質(zhì)印跡法中為什么檢測(cè)不到目的蛋白？
很多小伙伴在對(duì)膠片印跡進(jìn)行短暫曝光后，檢測(cè)不到目的蛋白。可從以下幾個(gè)方面來(lái)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)步驟：
1、裂解物制備
每道全細(xì)胞提取物的 20–30 ?g 總蛋白，通常足夠用來(lái)檢測(cè)。如果靶標(biāo)蛋白的基礎(chǔ)水平，或蛋白質(zhì)修飾程度低，可能需要通過化學(xué)刺激劑來(lái)誘導(dǎo)表達(dá)或修飾。你可能要調(diào)查備選細(xì)胞系或組織，其所含的目的蛋白含量geng高。應(yīng)將樣品溶解于適當(dāng)?shù)木彌_液中，該緩沖液包含蛋白酶抑制劑和針對(duì)磷酸化目標(biāo)的磷酸酶抑制劑。應(yīng)務(wù)必對(duì)裂解物進(jìn)行超聲處理，以確保有效的染色質(zhì)和膜結(jié)合靶標(biāo)的蛋白質(zhì)提取。請(qǐng)查看我們網(wǎng)站上的對(duì)照物表，獲得推薦的陽(yáng)性對(duì)照物和處理方法。
2、一抗稀釋和/或孵育
使用推薦的封閉劑（5% BSA 或 5% 脫脂奶粉），以推薦的稀釋度溶解于 TBST 中，在 4°C 下，過夜孵育一抗。使用備選封閉劑，如明膠、血清、無(wú)蛋白封閉劑、酪蛋白、或混合封閉劑，可能降低靶標(biāo)信號(hào)強(qiáng)度。如需單個(gè)抗體的優(yōu)化結(jié)果，請(qǐng)查詢產(chǎn)品數(shù)據(jù)表找到推薦的稀釋緩沖液。
3、SDS-PAGE 凝膠選擇
一般來(lái)說(shuō)，推薦采用 Tris-Glycine 凝膠。但是，對(duì)于高分子量蛋白質(zhì)，我們推薦采用 Tris-Acetate 凝膠和相關(guān)緩沖液。蛋白質(zhì)從 1 毫米凝膠轉(zhuǎn)移比從 1.5 毫米凝膠轉(zhuǎn)移geng有效。使用geng厚的凝膠，可能會(huì)導(dǎo)致高分子量蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移不完全，所以我們推薦監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)移效率，根據(jù)目的靶標(biāo)蛋白質(zhì)分子量大小，優(yōu)化轉(zhuǎn)移條件。
4、轉(zhuǎn)移和膜
可通過延長(zhǎng)轉(zhuǎn)移時(shí)間或使用geng高的電壓，可改善轉(zhuǎn)膜不完全。一般來(lái)說(shuō)，我們建議在轉(zhuǎn)移緩沖液中加入 20% 甲醇，然后在 70 V 電壓下進(jìn)行為時(shí) 2 小時(shí)的濕轉(zhuǎn)。對(duì)于高分子量蛋白質(zhì)，我們建議減少轉(zhuǎn)移緩沖液中的甲醇至 5%，以提高轉(zhuǎn)移效率并避免大分子蛋白質(zhì)在凝膠基質(zhì)中固定，并且在 70 V 電壓下延長(zhǎng)轉(zhuǎn)移時(shí)間至 3 小時(shí)。檢測(cè)較小的蛋白質(zhì)時(shí)，可能在轉(zhuǎn)膜期間出現(xiàn)過度轉(zhuǎn)移（過膜蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移）問題。對(duì)于小蛋白質(zhì)分子，使用孔隙大小為 0.2 ?m 的膜并在 70 V 電壓下進(jìn)行為時(shí) 1.5 小時(shí)的濕轉(zhuǎn)，而不是使用孔隙大小為 0.45 ?m 的膜或進(jìn)行過夜轉(zhuǎn)移，這樣做很重要，因?yàn)楹笳呖赡軙?huì)導(dǎo)致過度轉(zhuǎn)移和丟失小蛋白質(zhì)分子信號(hào)。
5、封閉
膜封閉時(shí)間過長(zhǎng)可能會(huì)掩蓋抗原表位，并阻止抗體結(jié)合。在室溫下僅封閉 1 小時(shí)。
6、洗滌
洗滌時(shí)間超過推薦的三次 5 分鐘是一個(gè)常見問題，可能會(huì)導(dǎo)致減少信號(hào)。我們推薦計(jì)時(shí)洗滌，以確保準(zhǔn)確性。TBST 應(yīng)包含 0.1% Tween? 20。這適用于一抗和二抗孵育后的洗滌步驟。此外，我們建議在 TBST 中洗滌，因?yàn)橐延袛?shù)據(jù)顯示在 PBST 中洗滌會(huì)導(dǎo)致減少信號(hào)。
7、二抗稀釋和/或孵育
可用相同的細(xì)胞提取物和一抗在印跡上進(jìn)行二抗的梯度稀釋，以優(yōu)化二抗?jié)舛取?wù)必在室溫下，在含 5% 脫脂奶粉的 TBST 中孵育二抗 1 小時(shí)。避免在 HRP-偶聯(lián)二抗的緩沖液中加入疊氮hua鈉，因?yàn)榀B氮化物會(huì)抑制 HRP 的活性。
8、檢測(cè)試劑
采用能用抗-生物素-HRP 進(jìn)行檢測(cè)的生物素化分子量標(biāo)準(zhǔn)作為化學(xué)發(fā)光檢測(cè)的陽(yáng)性對(duì)照物
1、裂解物制備
每道全細(xì)胞提取物的 20–30 ?g 總蛋白，通常足夠用來(lái)檢測(cè)。如果靶標(biāo)蛋白的基礎(chǔ)水平，或蛋白質(zhì)修飾程度低，可能需要通過化學(xué)刺激劑來(lái)誘導(dǎo)表達(dá)或修飾。你可能要調(diào)查備選細(xì)胞系或組織，其所含的目的蛋白含量geng高。應(yīng)將樣品溶解于適當(dāng)?shù)木彌_液中，該緩沖液包含蛋白酶抑制劑和針對(duì)磷酸化目標(biāo)的磷酸酶抑制劑。應(yīng)務(wù)必對(duì)裂解物進(jìn)行超聲處理，以確保有效的染色質(zhì)和膜結(jié)合靶標(biāo)的蛋白質(zhì)提取。請(qǐng)查看我們網(wǎng)站上的對(duì)照物表，獲得推薦的陽(yáng)性對(duì)照物和處理方法。
2、一抗稀釋和/或孵育
使用推薦的封閉劑（5% BSA 或 5% 脫脂奶粉），以推薦的稀釋度溶解于 TBST 中，在 4°C 下，過夜孵育一抗。使用備選封閉劑，如明膠、血清、無(wú)蛋白封閉劑、酪蛋白、或混合封閉劑，可能降低靶標(biāo)信號(hào)強(qiáng)度。如需單個(gè)抗體的優(yōu)化結(jié)果，請(qǐng)查詢產(chǎn)品數(shù)據(jù)表找到推薦的稀釋緩沖液。
3、SDS-PAGE 凝膠選擇
一般來(lái)說(shuō)，推薦采用 Tris-Glycine 凝膠。但是，對(duì)于高分子量蛋白質(zhì)，我們推薦采用 Tris-Acetate 凝膠和相關(guān)緩沖液。蛋白質(zhì)從 1 毫米凝膠轉(zhuǎn)移比從 1.5 毫米凝膠轉(zhuǎn)移geng有效。使用geng厚的凝膠，可能會(huì)導(dǎo)致高分子量蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移不完全，所以我們推薦監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)移效率，根據(jù)目的靶標(biāo)蛋白質(zhì)分子量大小，優(yōu)化轉(zhuǎn)移條件。
4、轉(zhuǎn)移和膜
可通過延長(zhǎng)轉(zhuǎn)移時(shí)間或使用geng高的電壓，可改善轉(zhuǎn)膜不完全。一般來(lái)說(shuō)，我們建議在轉(zhuǎn)移緩沖液中加入 20% 甲醇，然后在 70 V 電壓下進(jìn)行為時(shí) 2 小時(shí)的濕轉(zhuǎn)。對(duì)于高分子量蛋白質(zhì)，我們建議減少轉(zhuǎn)移緩沖液中的甲醇至 5%，以提高轉(zhuǎn)移效率并避免大分子蛋白質(zhì)在凝膠基質(zhì)中固定，并且在 70 V 電壓下延長(zhǎng)轉(zhuǎn)移時(shí)間至 3 小時(shí)。檢測(cè)較小的蛋白質(zhì)時(shí)，可能在轉(zhuǎn)膜期間出現(xiàn)過度轉(zhuǎn)移（過膜蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移）問題。對(duì)于小蛋白質(zhì)分子，使用孔隙大小為 0.2 ?m 的膜并在 70 V 電壓下進(jìn)行為時(shí) 1.5 小時(shí)的濕轉(zhuǎn)，而不是使用孔隙大小為 0.45 ?m 的膜或進(jìn)行過夜轉(zhuǎn)移，這樣做很重要，因?yàn)楹笳呖赡軙?huì)導(dǎo)致過度轉(zhuǎn)移和丟失小蛋白質(zhì)分子信號(hào)。
5、封閉
膜封閉時(shí)間過長(zhǎng)可能會(huì)掩蓋抗原表位，并阻止抗體結(jié)合。在室溫下僅封閉 1 小時(shí)。
6、洗滌
洗滌時(shí)間超過推薦的三次 5 分鐘是一個(gè)常見問題，可能會(huì)導(dǎo)致減少信號(hào)。我們推薦計(jì)時(shí)洗滌，以確保準(zhǔn)確性。TBST 應(yīng)包含 0.1% Tween? 20。這適用于一抗和二抗孵育后的洗滌步驟。此外，我們建議在 TBST 中洗滌，因?yàn)橐延袛?shù)據(jù)顯示在 PBST 中洗滌會(huì)導(dǎo)致減少信號(hào)。
7、二抗稀釋和/或孵育
可用相同的細(xì)胞提取物和一抗在印跡上進(jìn)行二抗的梯度稀釋，以優(yōu)化二抗?jié)舛取?wù)必在室溫下，在含 5% 脫脂奶粉的 TBST 中孵育二抗 1 小時(shí)。避免在 HRP-偶聯(lián)二抗的緩沖液中加入疊氮hua鈉，因?yàn)榀B氮化物會(huì)抑制 HRP 的活性。
8、檢測(cè)試劑
采用能用抗-生物素-HRP 進(jìn)行檢測(cè)的生物素化分子量標(biāo)準(zhǔn)作為化學(xué)發(fā)光檢測(cè)的陽(yáng)性對(duì)照物
