質(zhì)粒提取的方法與影響因素
質(zhì)粒是攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌中擴增或者表達(dá)的重要媒介，這種基因運載工具在基因工程中具有極廣泛的應(yīng)用價值，質(zhì)粒提取是分子生物學(xué)常見的實驗之一。目前質(zhì)粒提取實驗大多借助試劑盒來完成，那么關(guān)于質(zhì)粒提取的原理，您的了解足夠深入嗎？
目前，質(zhì)粒提取試劑盒蕞常用的方法是堿裂解法。堿裂解法原理：根據(jù)共價閉合環(huán)狀DNA與線性DNA的拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)差異來分離的。在強堿環(huán)境下，細(xì)菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜被破壞，基因組DNA和質(zhì)粒DNA被釋放出來，線性DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)被破壞而發(fā)生變性。雖然在強堿的條件下共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA也會發(fā)生變性，但兩條互補鏈仍會互相盤繞，并緊密的結(jié)合在一起。當(dāng)加入高鹽緩沖液使pH恢復(fù)中性時，共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA復(fù)性快，而線性的染色體DNA復(fù)性緩慢，細(xì)菌蛋白質(zhì)、破裂的細(xì)胞壁和變性的染色體DNA會相互纏繞成大型復(fù)合物。這樣，通過離心可沉淀大部分細(xì)胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)，再采用吸附柱對質(zhì)粒進(jìn)行吸附、去雜質(zhì)、洗脫，就完成了質(zhì)粒提取的實驗。
在進(jìn)行質(zhì)粒提取實驗室，有時候質(zhì)粒提取的濃度不高，達(dá)不到后續(xù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的實驗要求，那么可能是哪些原因造成的呢？下面一起來看一下質(zhì)粒提取有哪些影響因素吧！了解它的影響因素，就能夠做出相應(yīng)的實驗方案調(diào)整，從而得到高濃度的質(zhì)粒樣本啦！
影響質(zhì)粒提取的因素：
質(zhì)粒提取的得率和質(zhì)量與很多因素有關(guān)，如宿主菌的種類和培養(yǎng)條件、細(xì)胞的裂解、質(zhì)粒拷貝數(shù)、質(zhì)粒的穩(wěn)定性、抗生素等。
宿主菌的種類和培養(yǎng)條件
多數(shù)情況下宿主菌為大腸桿菌，而菌株的不同會影響質(zhì)粒提取的質(zhì)量。例如，HB101及其衍生菌株（TG1、JM系列）會在裂解時產(chǎn)生大量的糖類，如果沒有完全去除，將抑制后續(xù)實驗中的酶活性，影響質(zhì)粒DNA提取的質(zhì)量。
由于無質(zhì)粒的子細(xì)胞在無抗生素時復(fù)制速度遠(yuǎn)大于含質(zhì)粒的細(xì)胞。因此，宿主菌株接種到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的過程中，務(wù)必加入抗生素進(jìn)行篩選。宿主菌接種到含相應(yīng)抗生素的液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)12-16小時，不應(yīng)超過16小時。超過16小時后，細(xì)胞開始裂解，使得質(zhì)粒的得率降低，也可能導(dǎo)致質(zhì)粒丟失或質(zhì)粒變異。
不同質(zhì)粒間的差異
質(zhì)粒提取終的濃度，重要的影響因素之一就是質(zhì)粒拷貝數(shù)。質(zhì)粒拷貝數(shù)是指生長在標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)基下每個細(xì)菌細(xì)胞中所含有的質(zhì)粒DNA分子的數(shù)目，每個細(xì)菌中的質(zhì)粒的拷貝數(shù)主要決定于質(zhì)粒本身的復(fù)制特性。
按照復(fù)制機制，可以把質(zhì)粒分為兩類：一類是嚴(yán)緊型質(zhì)粒，當(dāng)細(xì)菌染色體復(fù)制一次時，質(zhì)粒也復(fù)制一次，每個細(xì)菌內(nèi)只含1-2個質(zhì)粒；另一類是松弛型質(zhì)粒，當(dāng)細(xì)菌染色體復(fù)制停止后仍然能繼續(xù)復(fù)制，每一個細(xì)菌內(nèi)一般含20個左右質(zhì)粒拷貝，這些質(zhì)粒的復(fù)制是在寄主的松弛控制之下的。高拷貝質(zhì)粒與低拷貝質(zhì)粒在相同條件下進(jìn)行質(zhì)粒提取，高拷貝質(zhì)粒濃度會高于低拷貝質(zhì)粒的濃度。不同拷貝數(shù)的質(zhì)粒，菌液量的需求不同，對于低拷貝的質(zhì)粒，要相應(yīng)增加菌液的量。
在細(xì)菌培養(yǎng)液中加入氯霉素可提高松弛型質(zhì)粒的拷貝數(shù)。因為氯霉素能抑制宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)和DNA的合成，但對松弛型質(zhì)粒的復(fù)制沒有影響。由于氯霉素抑制了宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)和DNA的合成，從而抑制了染色體的復(fù)制，但質(zhì)粒復(fù)制所用的酶半衰期較長，故質(zhì)粒仍可繼續(xù)復(fù)制，這樣既可增加質(zhì)粒產(chǎn)量，又可降低細(xì)胞的數(shù)量，使細(xì)菌裂解液的粘度降低而便于操作。氯霉素的使用濃度為20-170ug/ml，使用氯霉素能在一定程度上提高質(zhì)粒提取的濃度。
目前，質(zhì)粒提取試劑盒蕞常用的方法是堿裂解法。堿裂解法原理：根據(jù)共價閉合環(huán)狀DNA與線性DNA的拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)差異來分離的。在強堿環(huán)境下，細(xì)菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜被破壞，基因組DNA和質(zhì)粒DNA被釋放出來，線性DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)被破壞而發(fā)生變性。雖然在強堿的條件下共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA也會發(fā)生變性，但兩條互補鏈仍會互相盤繞，并緊密的結(jié)合在一起。當(dāng)加入高鹽緩沖液使pH恢復(fù)中性時，共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA復(fù)性快，而線性的染色體DNA復(fù)性緩慢，細(xì)菌蛋白質(zhì)、破裂的細(xì)胞壁和變性的染色體DNA會相互纏繞成大型復(fù)合物。這樣，通過離心可沉淀大部分細(xì)胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)，再采用吸附柱對質(zhì)粒進(jìn)行吸附、去雜質(zhì)、洗脫，就完成了質(zhì)粒提取的實驗。
在進(jìn)行質(zhì)粒提取實驗室，有時候質(zhì)粒提取的濃度不高，達(dá)不到后續(xù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的實驗要求，那么可能是哪些原因造成的呢？下面一起來看一下質(zhì)粒提取有哪些影響因素吧！了解它的影響因素，就能夠做出相應(yīng)的實驗方案調(diào)整，從而得到高濃度的質(zhì)粒樣本啦！
影響質(zhì)粒提取的因素：
質(zhì)粒提取的得率和質(zhì)量與很多因素有關(guān)，如宿主菌的種類和培養(yǎng)條件、細(xì)胞的裂解、質(zhì)粒拷貝數(shù)、質(zhì)粒的穩(wěn)定性、抗生素等。
宿主菌的種類和培養(yǎng)條件
多數(shù)情況下宿主菌為大腸桿菌，而菌株的不同會影響質(zhì)粒提取的質(zhì)量。例如，HB101及其衍生菌株（TG1、JM系列）會在裂解時產(chǎn)生大量的糖類，如果沒有完全去除，將抑制后續(xù)實驗中的酶活性，影響質(zhì)粒DNA提取的質(zhì)量。
由于無質(zhì)粒的子細(xì)胞在無抗生素時復(fù)制速度遠(yuǎn)大于含質(zhì)粒的細(xì)胞。因此，宿主菌株接種到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的過程中，務(wù)必加入抗生素進(jìn)行篩選。宿主菌接種到含相應(yīng)抗生素的液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)12-16小時，不應(yīng)超過16小時。超過16小時后，細(xì)胞開始裂解，使得質(zhì)粒的得率降低，也可能導(dǎo)致質(zhì)粒丟失或質(zhì)粒變異。
不同質(zhì)粒間的差異
質(zhì)粒提取終的濃度，重要的影響因素之一就是質(zhì)粒拷貝數(shù)。質(zhì)粒拷貝數(shù)是指生長在標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)基下每個細(xì)菌細(xì)胞中所含有的質(zhì)粒DNA分子的數(shù)目，每個細(xì)菌中的質(zhì)粒的拷貝數(shù)主要決定于質(zhì)粒本身的復(fù)制特性。
按照復(fù)制機制，可以把質(zhì)粒分為兩類：一類是嚴(yán)緊型質(zhì)粒，當(dāng)細(xì)菌染色體復(fù)制一次時，質(zhì)粒也復(fù)制一次，每個細(xì)菌內(nèi)只含1-2個質(zhì)粒；另一類是松弛型質(zhì)粒，當(dāng)細(xì)菌染色體復(fù)制停止后仍然能繼續(xù)復(fù)制，每一個細(xì)菌內(nèi)一般含20個左右質(zhì)粒拷貝，這些質(zhì)粒的復(fù)制是在寄主的松弛控制之下的。高拷貝質(zhì)粒與低拷貝質(zhì)粒在相同條件下進(jìn)行質(zhì)粒提取，高拷貝質(zhì)粒濃度會高于低拷貝質(zhì)粒的濃度。不同拷貝數(shù)的質(zhì)粒，菌液量的需求不同，對于低拷貝的質(zhì)粒，要相應(yīng)增加菌液的量。
在細(xì)菌培養(yǎng)液中加入氯霉素可提高松弛型質(zhì)粒的拷貝數(shù)。因為氯霉素能抑制宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)和DNA的合成，但對松弛型質(zhì)粒的復(fù)制沒有影響。由于氯霉素抑制了宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)和DNA的合成，從而抑制了染色體的復(fù)制，但質(zhì)粒復(fù)制所用的酶半衰期較長，故質(zhì)粒仍可繼續(xù)復(fù)制，這樣既可增加質(zhì)粒產(chǎn)量，又可降低細(xì)胞的數(shù)量，使細(xì)菌裂解液的粘度降低而便于操作。氯霉素的使用濃度為20-170ug/ml，使用氯霉素能在一定程度上提高質(zhì)粒提取的濃度。
