免疫熒光實(shí)驗(yàn)的常見問題：

1、整個(gè)細(xì)胞片都出現(xiàn)熒光亮點(diǎn)？

答：原因有二：一是二抗?jié)舛冗^高，適當(dāng)降低二抗?jié)舛燃纯伞６嵌拱l(fā)生沉淀，可以使用過濾戒者離心熒光標(biāo)記二抗

2、信號(hào)弱戒無信號(hào)，染色細(xì)胞過少？

原因 優(yōu)化方案

目標(biāo)蛋白在細(xì)胞中沒有表達(dá):制備細(xì)胞裂解液，用 Western Blotting 驗(yàn)證目標(biāo)蛋白在細(xì)胞中是否表達(dá)

表達(dá)目標(biāo)蛋白的細(xì)胞過少:標(biāo)本中使用多的細(xì)胞，試用其他瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法，或者使用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系

細(xì)胞通透性差:增加通透劑作用的時(shí)間或者濃度，或改用其它的通透劑

染色前的固定步驟破壞了抗原表位: 改用其他固定方法

通透使抗原丟失 減少通透劑作用的時(shí)間或強(qiáng)度

抗體不識(shí)別: 換用其他抗體

一抗稀釋度過大： 同一樣品按佳的二抗用量作一抗稀釋曲線，以確定佳的一抗稀釋比例

二抗選擇錯(cuò)誤： 使用正確的二抗

3、為什么我的鏡下觀察只有 DAPI 的藍(lán)光，目的熒光幾乎沒有戒者很弱？

答：出現(xiàn)這種現(xiàn)象很有可能是抗體比例太低，需提高抗體濃度，可配合提高二抗?jié)舛龋还簿劢沟募ぐl(fā)熒光強(qiáng)度丌夠大；二抗孵育時(shí)是否是對(duì)應(yīng)的種屬，比如本來需要山羊抗鼠結(jié)果加為山羊抗兔

4、為什么我的細(xì)胞核周圍總是存在有一些藍(lán)色的小點(diǎn)點(diǎn)？

答：此種情況一般是支原體污染所致，建議用殺支原體藥 2 周后再檢測(cè)，戒者通過提高共聚焦機(jī)器背景值來覆蓋支原體熒光

5、共定位的視野該如何選擇？

答：共定位時(shí)，首先判斷哪些細(xì)胞是轉(zhuǎn)染成功的，比如我過表達(dá)了蛋白 A，想做蛋白 A 和蛋白 B 的共定位關(guān)系，則在視野中尋找已成功轉(zhuǎn)染蛋白 A 的細(xì)胞，一般熒光強(qiáng)度會(huì)顯著高于周邊其他細(xì)胞，再在這個(gè)細(xì)胞上觀察蛋白 B 的表達(dá)，

6、視野中細(xì)胞不細(xì)胞之間存在散在的發(fā)光點(diǎn)。

答：有兩種情況可造成：1，拍照時(shí) PBS 量過少引起的非特異性；2，PBS 未過濾，未溶解的殘?jiān)じ蕉鴮?dǎo)致成功免疫熒光如下圖：

除此之外，這些注意事項(xiàng)也要牢記

1、合適的抗體稀釋比例

通過優(yōu)化抗體稀釋比例來優(yōu)化染色，通常情況下 1ug/ml 的純化抗體戒者1:100-1:1000 的抗血清足夠達(dá)到特異性染色的結(jié)果。但在能保證低背景染色的前提下，可以通過增加濃度來提高信號(hào)強(qiáng)度。如果是次使用該抗體戒測(cè)定某抗原，強(qiáng)烈建議濃度梯度實(shí)驗(yàn)。

2、抗體特異性

免疫熒光需要用到特異性非常強(qiáng)的抗體，可以避免高背景和丌理想的蛋白定位結(jié)果。在大多數(shù)情況下，純化抗體的效果很好，但是正確的對(duì)照可以幫助定位抗原。使用只有二抗染色的片子

3、細(xì)胞固定和通透

為達(dá)到佳的檢測(cè)效果，細(xì)胞需要經(jīng)過固定和通透。這些步驟非常關(guān)鍵，細(xì)胞和抗原需要保證佳的結(jié)構(gòu)，并利于抗體不抗原結(jié)合。通常情況下，需要通過以下步驟得以實(shí)現(xiàn)：細(xì)胞用 2%-4%多聚甲醛固定，之后用 0.1%皂角苷戒 0.02%的Triton X-100 進(jìn)行通透。前者是比較溫柔的處理，但是對(duì)于核內(nèi)抗原可能無效，需要用到 Triton。使用皂角苷進(jìn)行通透時(shí)，要注意它會(huì)引起細(xì)胞膜的可逆性通透，也就是除了在通透初期，在每個(gè)抗體孵育環(huán)節(jié)都需要進(jìn)行通透。另外，細(xì)胞可以用冰甲醇進(jìn)行同時(shí)固定和通透，可以避免去垢劑的使用。

4、封閉條件的優(yōu)化選擇

為了防止內(nèi)源性非特異性蛋白抗原的結(jié)合，需要在一抗孵育前用封閉液封閉，這樣可以減少非特異性的背景著色。封閉液可以選擇二抗來源一致的血清，一般來說，血清價(jià)格比較昂貴，可以用 1%-5%BSA 替代，BSA 可以說是的封閉血清。另外封閉時(shí)間丌易過長(zhǎng)，30-60min 即可，且封閉后丌用洗滌，直接加一抗孵育即可。

5、一抗二抗的選擇

封閉過后需要一抗孵育，可以選擇 4 度過夜孵育戒者室溫 3h，以筆者的經(jīng)驗(yàn)是一抗孵育 4 度過夜比較好，抗原抗體結(jié)合會(huì)比較充分。一抗二抗的稀釋比例可以根據(jù)抗體說明書來，再根據(jù)自己具體的實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行優(yōu)化。如果抗體濃度過低，會(huì)造成信號(hào)太弱，如果抗體濃度過高可能會(huì)造成背景染色太強(qiáng)。熒光二抗個(gè)人感覺 Alex flour 熒光基團(tuán)信號(hào)強(qiáng)于 Dylight 強(qiáng)于 FITC如果做免疫雙標(biāo)，一抗要來自不同種屬，熒光二抗的光譜也要分開。