古朵技術(shù)分享：PCR技術(shù)原理、實(shí)驗(yàn)步驟和應(yīng)用

  一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?

  1.掌握聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的原理。

  2.掌握移液槍和PCR儀的基本操作技術(shù)。

  二、實(shí)驗(yàn)原理

  PCR技術(shù)，即聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction，PCR)是由美國(guó)PECetus公司的KaryMullis在1983年(1993年獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng))建立的。這項(xiàng)技術(shù)可在試管內(nèi)的經(jīng)數(shù)小時(shí)反應(yīng)就將特定的DNA片段擴(kuò)增數(shù)百萬(wàn)倍，這種迅速獲取大量單一核酸片段的技術(shù)在分子生物學(xué)研究中具有舉足輕重的意義，極大地推動(dòng)了生命科學(xué)的研究進(jìn)展。它不僅是DNA分析zui常用的技術(shù)，而且在DNA重組與表達(dá)、基因結(jié)構(gòu)分析和功能檢測(cè)中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

  PCR可以被認(rèn)為是與發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制過程相似的技術(shù)，其結(jié)果都是以原來的DNA為模板產(chǎn)生新的互補(bǔ)DNA片段。細(xì)胞中DNA的復(fù)制是一個(gè)非常復(fù)雜的過程。參與復(fù)制的有多種因素。PCR是在試管中進(jìn)行的DNA復(fù)制反應(yīng)，基本原理與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制相似，但反應(yīng)體系相對(duì)較簡(jiǎn)單。

  PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：

  ①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)做準(zhǔn)備;

  ②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合;

  ③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在Taq酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。

  重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。

  三、實(shí)驗(yàn)試劑與器材

  模板DNA、2.5mmol/LdNTP

  TaqDNA聚合酶(5U/μL)、SSR引物

  10×buffer、15mmol/LMg2+、ddH2O

  PCR儀、移液槍、PCR板

  四、實(shí)驗(yàn)步驟

  1、配制20μL反應(yīng)體系，在PCR板中依次加入下列溶液：

  模板DNA2μL

  引物11μL

  引物21μL

  dNTP1.5μL

  MgCl22μL

  10×buffer2μL

  ddH2O10μL

  Taq酶0.5μL

  2、設(shè)置PCR反應(yīng)程序。

  3、上樣，啟動(dòng)反應(yīng)程序。

  4、擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)。

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