實(shí)驗(yàn)快訊：關(guān)于ELISA實(shí)驗(yàn)測(cè)定成果過(guò)錯(cuò)的原因總結(jié)

  ELISA方法被廣泛使用于各種抗原和抗體測(cè)定，具有靈敏度高，操作簡(jiǎn)單等長(zhǎng)處，但是在具體試驗(yàn)過(guò)程中影響要素較多，而且要按照嚴(yán)厲的說(shuō)明要求，在臨床查驗(yàn)中除正常反響外，有時(shí)?？梢?jiàn)到一些過(guò)錯(cuò)成果(即假陽(yáng)性或假陰性成果)。

  引起ELISA測(cè)定過(guò)錯(cuò)成果的原因主要有：①標(biāo)本要素;②試劑要素;③操作要素。本文就標(biāo)本要素對(duì)ELISA測(cè)定的影響做如下評(píng)論。

  血清是常用的ELISA標(biāo)本，血漿一般可視為與血清平等的標(biāo)本，標(biāo)本引起的假陽(yáng)性和假陰性成果主要是攪擾性物質(zhì)所構(gòu)成的，分為內(nèi)源性物質(zhì)和外源性物質(zhì)兩種：

  1. 內(nèi)源性物質(zhì)

  普遍認(rèn)為大約40%的人血清標(biāo)本中含有非特異性攪擾物質(zhì)，能夠不同程度影響檢測(cè)成果。常見(jiàn)的攪擾物質(zhì)有：類風(fēng)濕因子、補(bǔ)體、嗜異性抗體、嗜靶抗原本身抗體、醫(yī)源性誘導(dǎo)的抗鼠Ig (s)抗體、穿插反響物質(zhì)和其它物質(zhì)等。

  (1)類風(fēng)濕因子

  人血清中IgM、IgG型類風(fēng)濕因子(RF)能夠與ELISA體系中的捕獲抗體及酶符號(hào)二抗的FC段直接結(jié)合，然后導(dǎo)致假陽(yáng)性。處理該狀況的方法是：①用F(ab)2代替完好的IgG;②標(biāo)本用聯(lián)有熱變性(63℃，10 min)IgG的固相吸附劑處理(將熱變性IgG參加到標(biāo)本稀釋液中同樣有用);③檢測(cè)抗原時(shí)，能夠用等參加到標(biāo)本稀釋液中，使RF降解。

  (2)補(bǔ)體

  ELISA體系中固相一抗和符號(hào)二抗過(guò)程中，抗體分子發(fā)作變構(gòu)，其FC段的補(bǔ)體C1q分子結(jié)合位點(diǎn)被露出出來(lái)，使C1q 能夠?qū)⒍哌B接起來(lái)，然后構(gòu)成假陽(yáng)性。處理的方法是：①用EDTA稀釋標(biāo)本;②用53℃，10 min或56℃，30 min加熱血清使C1q滅活。

  (3)嗜異性抗體

  人類血清中含有能與嚙齒類動(dòng)物(如鼠等)Ig (s) 結(jié)合的天然嗜異性抗體，可將ELISA體系中一抗和二抗連接起來(lái)，也能構(gòu)成假陽(yáng)性。處理的方法是：可在標(biāo)本稀釋液中參加過(guò)量的動(dòng)物Ig (s) ，但參加量缺乏或亞類不一起無(wú)效。

  (4)嗜靶抗原的本身抗體

  抗甲狀腺球蛋白、抗胰島素等嗜靶抗原的本身抗體，有時(shí)能與靶抗原結(jié)合構(gòu)成復(fù)合物，在ELISA方法中均可攪擾抗原抗體測(cè)定成果。為防止以上狀況呈現(xiàn)，處理的方法是：測(cè)定前需用理化方法將其解離后再測(cè)定。

  (5)醫(yī)源性誘導(dǎo)的抗鼠Ig (s) 抗體

  臨床展開(kāi)的用鼠源性CD3等單克隆抗體醫(yī)治，用放射性同位素符號(hào)鼠源性抗體的影像確診及靶向醫(yī)治等新技術(shù)，均有可能使這些患者體內(nèi)發(fā)生抗鼠抗體;別的，被鼠等嚙齒類動(dòng)物咬傷的患者體內(nèi)也能夠發(fā)生抗鼠Ig (s) 抗體。這些患者ELISA測(cè)守時(shí)均可發(fā)生假陽(yáng)性。處理的方法是：測(cè)定抗原時(shí)，在標(biāo)本中參加足量的正常鼠Ig (s) ，然后戰(zhàn)勝因?yàn)樯鲜鲈驑?gòu)成的假陽(yáng)性。

  (6)穿插反響物質(zhì)

  類類AFP樣物質(zhì)等，是與靶抗原有穿插反響的物質(zhì)。在用多抗測(cè)定抗原時(shí)對(duì)測(cè)定成果影響不大，但在用單克隆抗體測(cè)定抗原時(shí)，如果穿插抗原決定簇正好是所用單克隆抗體相對(duì)應(yīng)的靶決定簇時(shí)，也會(huì)呈現(xiàn)假陽(yáng)性成果。

  (7)標(biāo)本中其它成分的影響 血清脂質(zhì)過(guò)高、膽紅素、血紅蛋白及血液粘度過(guò)大等，均對(duì)ELISA測(cè)定成果有攪擾效果。

  2. 外源性物質(zhì)

  外源性物質(zhì)常常是因?yàn)橛糜贓LISA測(cè)定的血標(biāo)本的收集、儲(chǔ)存不妥等原因所構(gòu)成的。如標(biāo)本溶血、標(biāo)本被細(xì)菌污染、標(biāo)本儲(chǔ)存過(guò)久、標(biāo)本凝聚不全和采血管中添加物等影響。

  (1)標(biāo)本溶血

  因?yàn)楦鞣N人為原因引起的標(biāo)本溶血，均可因紅細(xì)胞損壞溶解時(shí)釋放出很多具有過(guò)氧化物酶活性的血紅蛋白，在以辣根過(guò)氧化物酶為符號(hào)的ELISA測(cè)定中，會(huì)導(dǎo)致非特異性顯色，攪擾測(cè)定成果。為戰(zhàn)勝上述攪擾效果，標(biāo)本收集時(shí)有必要留意防止溶血。

  (2)標(biāo)本受細(xì)菌污染

  因菌體中可能含有內(nèi)源性辣根過(guò)氧化物酶，因而，被細(xì)菌污染的標(biāo)本同溶血標(biāo)本一樣，亦可發(fā)生非特異性顯色而攪擾測(cè)定成果。

  (3)標(biāo)本保存不妥

  在冰箱中保存過(guò)久的標(biāo)本，血清中IgG可聚合成多聚體、AFP可構(gòu)成二聚體，在間接法ELISA測(cè)定中會(huì)導(dǎo)致本底過(guò)深、乃至構(gòu)成假陽(yáng)性;標(biāo)本放置時(shí)刻過(guò)長(zhǎng)(如一天以上)，有時(shí)抗原或抗體免疫活性削弱，亦可呈現(xiàn)假陰性。為戰(zhàn)勝上述攪擾，ELISA測(cè)定的血清標(biāo)本宜為新鮮收集;如不能當(dāng)即測(cè)定，5天內(nèi)測(cè)定的血清標(biāo)本可存放于4℃，1周后測(cè)定的血清標(biāo)本應(yīng)低溫凍存;凍存后融解的標(biāo)本，蛋白質(zhì)部分濃縮，散布不均，應(yīng)充沛混合后再測(cè)定，但混勻時(shí)應(yīng)輕柔，不行激烈振動(dòng)。

  (4)標(biāo)本凝聚不全

  在沒(méi)有促凝劑和抗凝劑存在的狀況下，正常血液收集后1/2~2h開(kāi)端凝結(jié)，18~24h徹底凝結(jié)。臨床查驗(yàn)工作中，有時(shí)為了爭(zhēng)取時(shí)刻快速檢測(cè)，常在血液還未開(kāi)端凝結(jié)時(shí)即強(qiáng)行離心別離血清，此刻的血清中仍殘留部分纖維蛋白原，在ELISA測(cè)定過(guò)程中能夠構(gòu)成肉眼可見(jiàn)的纖維蛋白塊，易構(gòu)成假陽(yáng)性成果;這類狀況于次日復(fù)查時(shí)因血凝已徹底，血清中不再有纖維蛋白原存在，故復(fù)查成果變?yōu)殛幮浴榉乐股鲜鰯嚁_效果，處理的方法zui好是血液標(biāo)本收集后有必要使其充沛凝結(jié)后再別離血清，或標(biāo)本收集時(shí)用帶別離膠的采血管或于采血管中參加恰當(dāng)?shù)拇倌齽?

  (5)標(biāo)本管中添加物質(zhì)的影響

  抗凝劑(如肝素，EDTA)、酶抑制劑(如NaN3可抑制ELISA體系中辣根過(guò)氧化物酶活性)及快速別離血清的別離膠等均對(duì)ELISA測(cè)定有必定攪擾效果。

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