Western 免疫印跡具體操作說明書

  實驗試劑

  1. SDS-PAGE試劑:見電泳實驗。

  2. 勻漿緩沖液：1.0M Tris-HCl(pH 6.8)1.Oml;10%SDS 6.0ml;β-巰基乙醇 0.2ml;ddH2O 2.8ml。

  3. 轉膜緩沖液：甘氨酸 2.9g;Tris 5.8g;SDS 0.37g;甲醇200ml;加ddH2O定容至1000ml。

  4. 0.01M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0g;KCl 0.2g;Na2HPO4 1.44g;KH2PO4 0.24g;加ddH2O至1000ml。

  5. 膜染色液：考馬斯亮蘭 0.2g;甲醇80ml;乙酸2ml;ddH2O118 ml。包被液(5%脫脂奶粉，現配)：脫脂奶粉1.0g溶于20ml的0.01M PBS中。

  6. 顯色液：DAB 6.0mg;0.01M PBS 10.0ml;硫酸鎳胺 0.1ml;H2O2 1.0μl。

  實驗步驟

  1. 蛋白質樣品獲得：細菌誘導表達后，可通過電泳上樣緩沖液直接裂解細胞，真核細胞加勻漿緩沖液，機械或超聲波室溫勻漿0.5-1min。然后4℃，13,000g離心15min。取上清液作為樣品。

  2. 電泳：制備電泳凝膠，進行SDS-PAGE。

  3. 轉移：(半干式轉移)

  (1) 電泳結束后將膠條割至合適大小，用轉膜緩沖液平衡，5min×3次。

  (2) 膜處理：預先裁好與膠條同樣大小的濾紙和NC膜，浸入轉膜緩沖液中10min。

  (3) 轉膜：轉膜裝置從下至上依次按陽極碳板、24層濾紙、NC膜、凝膠、24層濾紙、陰極碳板的順序放好，濾紙、凝膠、NC膜對齊，每一步去除氣泡，上壓500g重物，將碳板上多余的液體吸干。接通電源,恒流1mA/cm2，轉移1.5hr。轉移結束后，斷開電源將膜取出,割取待測膜條做免疫印跡。將有蛋白標準的條帶染色，放入膜染色液中50s后，在50%甲醇中多次脫色，至背景清晰，然后用雙蒸水洗，風干夾于兩層濾紙中保存，留與顯色結果作對比。

  4. 免疫反應：

  (1) 用0.01M PBS洗膜，5min ×3次。

  (2) 加入包被液，平穩搖動，室溫2hr。

  (3) 棄包被液，用0.01M PBS洗膜，5min×3次。

  (4) 加入一抗(按合適稀釋比例用0.01M PBS稀釋，液體必須覆蓋膜的全部)，4℃放置12hr以上。陰性對照，以1%BSA取代一抗，其余步驟與實驗組相同。

  (5) 棄一抗和1%BSA，用0.01M PBS分別洗膜，5min×4次。

  (6) 加入辣根過氧化物酶偶聯的二抗(按合適稀釋比例用0.01M PBS稀釋)，平穩搖動，室溫2hr。

  (7) 棄二抗，用0.01M PBS洗膜，5min×4次。

  (8) 加入顯色液，避光顯色至出現條帶時放入雙蒸水中終止反應。

  注意事項

  1. 一抗、二抗的稀釋度、作用時間和溫度對不同的蛋白要經過預實驗確定*條件。

  2. 顯色液必須新鮮配置使用，zui后加入H2O2。

  3. DAB有致癌的潛在可能，操作時要小心仔細。

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