人白血病抑制因子(LIF)ELISA試劑盒使用說明書

  原理

  本實驗采用雙抗體夾心 ABC-ELISA法。用抗人 LIF 單抗包被于酶標板上，標準品和樣品中的 LIF與單抗結(jié)合，加入生物素化的抗人LIF，形成免疫復(fù)合物連接在板上，辣根過氧化物酶標記的Streptavidin與生物素結(jié)合，加入底物工作液顯藍色，后加終止液硫酸，在450nm處測OD值，LIF濃度與OD值成正比，可通過繪制標準曲線求出標本中LIF濃度。

  試劑盒組成(2-8℃保存)

  酶標板(Coated Wells)96孔酶標抗體工作液(Enzyme Conjugate)12ml

  10×標本稀釋液(Sample Buffer)12ml20×濃縮洗滌液(Wash Buffer)50ml

  標準品(Standards)：40ng/瓶2瓶底物工作液(TMB Solution)12ml

  抗體工作液(Biotinylated Antibody)12ml終止液(Stop Solution)12ml

  人白血病抑制因子(LIF)ELISA試劑盒準備試劑與收集血樣

  1. 收集標本：血清、血漿(EDTA、肝素抗凝)、細胞培養(yǎng)上清液、組織勻漿等盡早檢測，2-8℃保存48小時;長時間須冷凍(-20 ℃或-70 ℃)保存，避免反復(fù)凍融。

  2. 標準品液配制：使用前加入1ml蒸餾水混勻，配成40ng/ml的溶液。設(shè)標準管8管，管加標本稀釋液900ul，第二至第八管加入標本稀釋液500ul。在管中加入40ng/ml的標準品溶液100ul混勻后用加樣器吸出500ul，移至第二管。如此反復(fù)作對倍稀釋，從第七管中吸出500ul棄去。第八管為空白對照。

  3. 10×標本稀釋液用蒸餾水作1:10倍稀釋(示例：1ml濃稀釋液+9ml蒸餾水)。

  4. 洗滌液：用重蒸水1:20稀釋(示例：1ml濃縮洗滌液加入19ml的重蒸水)

  檢測程序

  1. 加樣：每孔各加入標準品或待測樣品100ul，將反應(yīng)板充分混勻后置37℃120分鐘。

  2. 洗板：用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4-6次，向濾紙上印干。

  3. 每孔中加入抗體工作液100ul。將反應(yīng)板充分混勻后置37℃60分鐘。

  4. 洗板：同前。

  5. 每孔加酶標抗體工作液100ul。將反應(yīng)板置37℃30分鐘。

  6. 洗板：同前。

  7. 每孔加入底物工作液100ul，置37 ℃暗處反應(yīng)15分鐘。

  8. 每孔加入100ul終止液混勻。

  9. 30分鐘內(nèi)用酶標儀在450nm處測吸光值。

  結(jié)果計算與判斷

  1. 所有OD值都應(yīng)減除空白值后再行計算。

  2. 以標準品4000、2000、1000、500、250、125、62.5、0 pg/ml為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上作圖，畫出標準曲線。

  3. 根據(jù)樣品OD值在該曲線圖上查出相應(yīng)LIF含量。

  試劑盒性能

  1. 靈敏度：小的LIF 檢測濃度小于30pg/ml。

  2. 特異性：可同時檢測重組或天然的人LIF。不與人其它細胞因子有交叉反應(yīng)。

  3. 重復(fù)性：板內(nèi)、板見變異系數(shù)均小于10%。

  注意事項

  1. 以上標準孔及待測樣品均建議做復(fù)孔，每次測定應(yīng)同時做標準曲線。

  2. 洗滌過程很關(guān)鍵。洗滌不充分將導(dǎo)致度誤差及OD值錯誤地升高。

  3. 板條開封后剩余板條要再封好，保持板條干燥。

  4. 本試劑盒宜置4oC冰箱保存。

  5. 本試劑盒僅用于科研，不能用于臨床診斷!

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