技術原理：免疫熒光染色原理及步驟

  免疫熒光又稱免疫熒光抗體。免疫熒光實驗原理是將熒光素標記在相應的抗體上，直接與相應抗原反應。其優點是方法簡便、特異性高，非特異性熒光染色少，相對使用標記抗體用量偏大。利用抗原抗體反應進行組織或細胞內抗原物質的定位。

  下面古朵生物詳細介紹免疫熒光染色步驟：

  1. 滴加 0.01mol/L，pH7.4 的PBS于待檢標本片上，10min后棄去，使標本保持一定濕度。

  2. 滴加適當稀釋的熒光標記的抗體溶液，使其覆蓋標本，置于有蓋搪瓷盒內，保溫一定時間(參考：30min)。

  3. 取出玻片，置玻片架上，先用 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 沖洗后，再按順序過 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 三缸浸泡，每缸 3-5 min，不時振蕩。

  4. 取出玻片，用濾紙吸去多余水分，但不使標本干燥，加一滴緩沖甘油，以蓋玻片覆蓋。

  5. 立即用熒光顯微鏡觀察。觀察標本的特異性熒光強度，一般可用“+"表示：(-)無熒光;(±)極弱的可疑熒光;(+)熒光較弱，但清楚可見;(++)熒光明亮;(+++--++++)熒光閃亮。待檢標本特異性熒光染色強度達“++"以上，而各種對照顯示為(±)或(-)，即可判定為陽性。

  免疫熒光實驗操作步驟：

  一、細胞準備：

  對單層生長細胞，在傳代培養時，將細胞接種到預先放置有處理過的蓋玻片的培養皿中，待細胞接近長成單層后取出蓋玻片，PBS洗兩次;對懸浮生長細胞，取對數生長細胞，用PBS離心洗滌(1000rpm,5min)2次，用細胞離心甩片機制備細胞片或直接制備細胞涂片。

  二、固定和透化

  1. 在培養板中將已爬好細胞的蓋玻片用1 × PBS浸洗3次，每次3 min。

  2. 用4%的多聚甲醛固定爬片15 min，1 × PBS浸洗玻片3次，每次3 min。

  3. 0.5% Triton X-100(1× PBS配制 )室溫通透細胞15 min(細胞膜上表達的抗原省略此步驟), 1 × PBS浸洗玻片3次，每次3min。

  三、封閉

  4. 吸水紙吸干1 ×PBS，在玻片上滴加5%的正常血清(與二抗種屬來源一致或相似)，室溫封閉1 h。

  四、抗體孵育

  5. 吸水紙吸掉封閉液，不洗，每張玻片滴加足夠量的稀釋好的一抗并放入濕盒，4 ℃孵育過夜。

  6. 加熒光二抗： PBST 浸洗爬片3次，每次3 min，吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗，濕盒中37℃孵育1 h，PBST浸洗爬片3次，每次3 min。

  注意：從加熒光二抗起，后面所有操作步驟都盡量在較暗處進行。

  五、固定拍照

  7. 復染核：滴加DAPI避光孵育5 min，對標本進行染核，PBST 5 min×4次洗去多余的DAPI。

  8. 用吸水紙吸干爬片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

  免疫熒光染色 上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦東新區。是一家專門從事生物技術相關產品，勵志研發和銷售的綜合性生物公司，產品遠銷多個國家和地區，我們將一如既往地秉承“一切為了滿足客戶的需求"的經營宗旨;牢固樹立“以客戶需求為準則、以市場需求為導向，不斷開發高質量的新產品，提供客戶滿意的綜合服務質量"的方針。