zui近小編的朋友圈已被各種秀恩愛的刷屏了，寶寶很是苦惱，在這個既溫馨又傷感的節(jié)日里，想想自己曾經(jīng)追過的女生，想想自己曾經(jīng)。。。，算了，還是想想曾經(jīng)困擾過自己的轉(zhuǎn)錄問題吧~RNA-seq已被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、臨床診斷和藥物研發(fā)等領(lǐng)域，今天小編就為大家整理了一波RNA-seq常見問題解答，給這個開學(xué)季的朋友圈來一點(diǎn)不一樣的.

樣本制備注意事項有哪些？

1.細(xì)胞類樣本送樣注意事項

細(xì)胞系樣本培養(yǎng)過程中常會出現(xiàn)支原體污染，將直接影響細(xì)胞生長狀態(tài)。對于去rRNA鏈特異性文庫，因去rRNA試劑盒具有物種、組織部位特異性，針對真核生物的去rRNA試劑盒無法去除支原體rRNA，會嚴(yán)重影響數(shù)據(jù)質(zhì)量以及有效數(shù)據(jù)比例，對分析結(jié)果的準(zhǔn)確度產(chǎn)生干擾。

建議細(xì)胞類樣本在測序前，先使用一步法支原體檢測試劑盒或qPCR技術(shù)進(jìn)行支原體檢測，從源頭有效避免支原體污染。

2.對于植物、動物、酵母等來源的RNA，一般推薦用哪種方法進(jìn)行提取

RNA提取質(zhì)量的好壞主要取決于樣品本身的新鮮程度和多糖多酚、次生代謝物的含量；針對大多數(shù)的動植物組織樣品，Trizol試劑都能獲得較好的提取效果；對于多糖含量特別豐富的植物組織，如棉花根、樺樹根、蘭花等，可采用天根多糖多酚試劑盒提取；對于脂肪組織，可采用QIAGEN的RNeasy lipidmini kit 進(jìn)行提取。

樣本檢測時需要達(dá)到什么要求才認(rèn)為樣品合格

樣本檢測主要關(guān)注的指標(biāo)為總量、RIN值、OD260/280以及28S/18S（原核生物為23S/16S）。其中RIN值及28S/18S是評估RNA完整性的主要指標(biāo)，RIN值越高，28S/18S越接近2表明完整性越好。一般RIN值大于6.5可嘗試建庫，RIN值過低會影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確度。但對于一些特殊樣品，比如某些昆蟲和水產(chǎn)動物，沒有28S條帶，就不能參考RIN值，一般只要18S前基線平穩(wěn)可認(rèn)為樣品合格。

生物學(xué)重復(fù)應(yīng)該如何來設(shè)定
 

1.區(qū)分生物學(xué)重復(fù)與技術(shù)重復(fù)

生物學(xué)重復(fù)：指樣本重復(fù)，不同生物樣本做同樣實驗；

技術(shù)重復(fù)：一般是對一個生物樣本的實驗指標(biāo)測定多次。

如下圖：對照組A、B、C三只小鼠（control A，B and C）互為生物學(xué)重復(fù)。實驗組A、B、C三只小鼠（Treated A）同樣互為生物學(xué)重復(fù)。任一小鼠在板A、B、C中被重復(fù)測量了三次，即技術(shù)重復(fù)了三次。

2.生物學(xué)重復(fù)設(shè)置幾個合適

一般推薦生物學(xué)重復(fù)≥3，動物或人的個體差異比較大，建議至少做5-10個重復(fù)。

3.生物學(xué)重復(fù)取樣要求

植物取樣：所取試驗田，長勢，外部形態(tài)特征相同；

動物取樣：遺傳背景，飼養(yǎng)條件，年齡，性別，外部形態(tài)特征相同；

混合取樣：保證混合樣品處理方式，處于發(fā)育階段，個體外部形態(tài)特征相同。

建庫方法如何選擇？

1.什么是鏈特異性文庫

鏈特異性建庫可以保留測序時轉(zhuǎn)錄本的方向信息，即可以確定轉(zhuǎn)錄本是來源于基因組上面的正義鏈還是反義鏈，此外，還能確定基因結(jié)構(gòu)，定量轉(zhuǎn)錄本，鑒定non-coding轉(zhuǎn)錄本等。

2.普通轉(zhuǎn)錄組與lncRNA建庫方法區(qū)別
 

普通轉(zhuǎn)錄組基于真核生物mRNA含有polyA尾的特性，先用oligodT磁珠富集純化，然后構(gòu)建普通轉(zhuǎn)錄組文庫。

因只有部分lncRNA含有polyA尾，為獲得更多的lncRNA有效信息，選用去rRNA試劑盒進(jìn)行富集，然后通過構(gòu)建鏈特異性文庫以有效區(qū)分不同lncRNA類型及準(zhǔn)確定位，保留RNA的方向性信息，以便更加準(zhǔn)確的獲得基因的結(jié)構(gòu)以及基因表達(dá)信息。
 

3.lncRNA測序前注意事項

 

1）必須有轉(zhuǎn)錄組，且參考基因組組裝水平及注釋信息完善，至少為scaffold水平。

2）需要有適用的去rRNA試劑盒。

目前主要應(yīng)用的去rRNA試劑盒為Ribo-Zero以及KAPA試劑盒。對于非常規(guī)物種進(jìn)行l(wèi)ncRNA測序時，需確定有無適用的去rRNA試劑盒，否則rRNA去除效果不佳會嚴(yán)重影響數(shù)據(jù)質(zhì)量。

篇幅有限，今天就告一段落，本期總結(jié)了RNA-seq樣本準(zhǔn)備和建庫問題，歡迎熱情點(diǎn)贊留言，小編會繼續(xù)整理分享，搓手抖腿期待中~~~我們下期不見不散~~~