原代細(xì)胞培養(yǎng)難？古朵實(shí)驗(yàn)來支招
長(zhǎng)期以來，人們認(rèn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)成熟的神經(jīng)元很難或不能在進(jìn)行分裂和增殖，屬于終末分化細(xì)胞。因而中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷、變性導(dǎo)致的神經(jīng)元丟失及缺損難以修復(fù)，神經(jīng)功能的重建被視為幾乎不可能。神經(jīng)干細(xì)胞在體外分離培養(yǎng)和增殖的成功，為中樞神經(jīng)系統(tǒng)再生和功能重建提供了新的可能途徑。
“養(yǎng)細(xì)胞難、養(yǎng)原代細(xì)胞geng難、養(yǎng)原代神經(jīng)干細(xì)胞難上加難！”
神經(jīng)干細(xì)胞
神經(jīng)干細(xì)胞是指具有分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的能力，能自我geng新并能提供大量腦組織細(xì)胞的細(xì)胞群，具有自我geng新能力和多向分化潛能，對(duì)損傷和疾病具有反應(yīng)能力。原代培養(yǎng)的單細(xì)胞在24h內(nèi)自動(dòng)聚集成團(tuán)，這是神經(jīng)干細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中的一個(gè)重要特征。
原代取材及培養(yǎng)
步驟一.原代取材：
1.脫頸處死2周齡孕鼠，孕鼠腹部以75%酒精消毒后，手術(shù)剪打開腹腔，取出子宮，剪開子宮，取出胎鼠，置于含冰冷PBS液的10cm培養(yǎng)皿中。
2.將胎鼠斷頭，用眼科剪分離顱骨及硬腦膜，取出腦組織，在顯微鏡下充分取出腦膜和血管組織。
3.將腦組織用PBS清洗三次，剪成1mm3大小的組織塊，至于含DMEM/F12的離心管中，吸管輕吹打10次，靜置離心管1~2min，取細(xì)胞懸液。重復(fù)2-3次。
4.細(xì)胞懸液以700r/min離心6min,吸除上清，獲得細(xì)胞沉淀。用(DMEM/F12+1%N2+2%B27+bFGF20mg/ml+EFG20mg/ml)重懸后，過200目篩網(wǎng)，并計(jì)數(shù)。
5.按5×105/ml密度接種，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)。2天后隔天換液。通常一周左右，神經(jīng)球長(zhǎng)出。
步驟二.傳代培養(yǎng)：
1.在光鏡下觀察細(xì)胞球中心已出現(xiàn)灰黑色區(qū)域時(shí)進(jìn)行傳代，將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至15ml離心中，800r/min離心5min，棄上清。
2.加入0.125%胰酶+0.02%EDTA消化2-3min，加入胰酶抑制劑終止消化，輕輕吹打神經(jīng)球至至細(xì)胞懸液， 800r/min離心5min，棄上清。
3.加入適量干細(xì)胞培養(yǎng)液Neurobasal +1%N2+2%B27+20ng/ml bFGF，20ng/ml EGF（添加谷氨酰胺），調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105/ml，置于37℃，5%CO2繼續(xù)傳代培養(yǎng)。
實(shí)驗(yàn)影響因素1.供體年齡的影響
實(shí)驗(yàn)研究顯示，胚胎鼠大腦皮質(zhì)中的神經(jīng)干數(shù)量明顯高于新生鼠，且胎齡為12~15d左右的鼠胚胎體內(nèi)的神經(jīng)干的分化能力zui強(qiáng)。
2.分離方法對(duì)細(xì)胞純度及活力的影響
常用的細(xì)胞分離方法有機(jī)械分離法和酶消化分離法。機(jī)械分離法的缺點(diǎn)是吹力度和次數(shù)不易掌控，且機(jī)械切割作用會(huì)使細(xì)胞活性降低；酶消化法缺點(diǎn)是消化的時(shí)間不易掌握，并且用于分離神經(jīng)干細(xì)胞的消化酶對(duì)細(xì)胞具有潛在的損害作用。
3.接種密度對(duì)神經(jīng)干的影響
神經(jīng)干細(xì)胞的適宜接種濃度一般可用1×10*8/L~1×10*9/L，接種細(xì)胞密度過小，細(xì)胞不成球，不利于細(xì)胞增殖；接種細(xì)胞密度過大，第1次傳代后很快出現(xiàn)死亡、特大、散亂、單細(xì)胞數(shù)迅速增多。采用半量換液的方法可以zui大程度地使細(xì)胞生存環(huán)境保持穩(wěn)定,有利于細(xì)胞生長(zhǎng)。
4.傳代培養(yǎng)時(shí)機(jī)的影響
神經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)過原代培養(yǎng)后中，細(xì)胞數(shù)量大量增殖，必將導(dǎo)致大部分神經(jīng)干細(xì)胞因缺乏營(yíng)養(yǎng)而死亡，因此及時(shí)進(jìn)行傳代是防止其死亡的關(guān)鍵，有文獻(xiàn)報(bào)道一般選用原代培養(yǎng)5~7 d時(shí)進(jìn)行，既可避免細(xì)胞過度增殖而死亡, 又保持細(xì)胞增殖的活性。
注意事項(xiàng)
1.為維持取材過程中的細(xì)胞活性，在取材整個(gè)過程中應(yīng)都在冰上進(jìn)行并且在剝離腦膜和血管組織中要在含有10%FBS高糖培養(yǎng)基中，因?yàn)樘ナ笊窠?jīng)干代謝旺盛，長(zhǎng)時(shí)間在無糖環(huán)境對(duì)神經(jīng)干造成損傷。
2.在取材過程中，不要取一個(gè)皮層，剝離一個(gè)腦膜血管，而是快速將所有胎鼠皮層取下來，放到高糖培養(yǎng)基中。
3.剝離腦膜及血管應(yīng)全部分離干凈，否則在制作單細(xì)胞懸液時(shí)，會(huì)被迫加大吹打力量和次數(shù)，造成細(xì)胞損傷。
4.在培養(yǎng)過程中，為防止細(xì)胞貼壁分化，隔天輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)基。
5.避免細(xì)胞污染。加強(qiáng)無菌操作意識(shí)，做好實(shí)驗(yàn)室、實(shí)驗(yàn)器械等的消毒工
“養(yǎng)細(xì)胞難、養(yǎng)原代細(xì)胞geng難、養(yǎng)原代神經(jīng)干細(xì)胞難上加難！”
今天，古朵生物為大家詳細(xì)講解原代神經(jīng)干細(xì)胞取材及培養(yǎng)的那些事，手把手教你輕松搞定~
神經(jīng)干細(xì)胞
神經(jīng)干細(xì)胞是指具有分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的能力，能自我geng新并能提供大量腦組織細(xì)胞的細(xì)胞群，具有自我geng新能力和多向分化潛能，對(duì)損傷和疾病具有反應(yīng)能力。原代培養(yǎng)的單細(xì)胞在24h內(nèi)自動(dòng)聚集成團(tuán)，這是神經(jīng)干細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中的一個(gè)重要特征。
原代取材及培養(yǎng)
步驟一.原代取材：
1.脫頸處死2周齡孕鼠，孕鼠腹部以75%酒精消毒后，手術(shù)剪打開腹腔，取出子宮，剪開子宮，取出胎鼠，置于含冰冷PBS液的10cm培養(yǎng)皿中。
2.將胎鼠斷頭，用眼科剪分離顱骨及硬腦膜，取出腦組織，在顯微鏡下充分取出腦膜和血管組織。
3.將腦組織用PBS清洗三次，剪成1mm3大小的組織塊，至于含DMEM/F12的離心管中，吸管輕吹打10次，靜置離心管1~2min，取細(xì)胞懸液。重復(fù)2-3次。
4.細(xì)胞懸液以700r/min離心6min,吸除上清，獲得細(xì)胞沉淀。用(DMEM/F12+1%N2+2%B27+bFGF20mg/ml+EFG20mg/ml)重懸后，過200目篩網(wǎng)，并計(jì)數(shù)。
5.按5×105/ml密度接種，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)。2天后隔天換液。通常一周左右，神經(jīng)球長(zhǎng)出。
步驟二.傳代培養(yǎng)：
1.在光鏡下觀察細(xì)胞球中心已出現(xiàn)灰黑色區(qū)域時(shí)進(jìn)行傳代，將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至15ml離心中，800r/min離心5min，棄上清。
2.加入0.125%胰酶+0.02%EDTA消化2-3min，加入胰酶抑制劑終止消化，輕輕吹打神經(jīng)球至至細(xì)胞懸液， 800r/min離心5min，棄上清。
3.加入適量干細(xì)胞培養(yǎng)液Neurobasal +1%N2+2%B27+20ng/ml bFGF，20ng/ml EGF（添加谷氨酰胺），調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105/ml，置于37℃，5%CO2繼續(xù)傳代培養(yǎng)。
實(shí)驗(yàn)影響因素1.供體年齡的影響
實(shí)驗(yàn)研究顯示，胚胎鼠大腦皮質(zhì)中的神經(jīng)干數(shù)量明顯高于新生鼠，且胎齡為12~15d左右的鼠胚胎體內(nèi)的神經(jīng)干的分化能力zui強(qiáng)。
2.分離方法對(duì)細(xì)胞純度及活力的影響
常用的細(xì)胞分離方法有機(jī)械分離法和酶消化分離法。機(jī)械分離法的缺點(diǎn)是吹力度和次數(shù)不易掌控，且機(jī)械切割作用會(huì)使細(xì)胞活性降低；酶消化法缺點(diǎn)是消化的時(shí)間不易掌握，并且用于分離神經(jīng)干細(xì)胞的消化酶對(duì)細(xì)胞具有潛在的損害作用。
3.接種密度對(duì)神經(jīng)干的影響
神經(jīng)干細(xì)胞的適宜接種濃度一般可用1×10*8/L~1×10*9/L，接種細(xì)胞密度過小，細(xì)胞不成球，不利于細(xì)胞增殖；接種細(xì)胞密度過大，第1次傳代后很快出現(xiàn)死亡、特大、散亂、單細(xì)胞數(shù)迅速增多。采用半量換液的方法可以zui大程度地使細(xì)胞生存環(huán)境保持穩(wěn)定,有利于細(xì)胞生長(zhǎng)。
4.傳代培養(yǎng)時(shí)機(jī)的影響
神經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)過原代培養(yǎng)后中，細(xì)胞數(shù)量大量增殖，必將導(dǎo)致大部分神經(jīng)干細(xì)胞因缺乏營(yíng)養(yǎng)而死亡，因此及時(shí)進(jìn)行傳代是防止其死亡的關(guān)鍵，有文獻(xiàn)報(bào)道一般選用原代培養(yǎng)5~7 d時(shí)進(jìn)行，既可避免細(xì)胞過度增殖而死亡, 又保持細(xì)胞增殖的活性。
注意事項(xiàng)
1.為維持取材過程中的細(xì)胞活性，在取材整個(gè)過程中應(yīng)都在冰上進(jìn)行并且在剝離腦膜和血管組織中要在含有10%FBS高糖培養(yǎng)基中，因?yàn)樘ナ笊窠?jīng)干代謝旺盛，長(zhǎng)時(shí)間在無糖環(huán)境對(duì)神經(jīng)干造成損傷。
2.在取材過程中，不要取一個(gè)皮層，剝離一個(gè)腦膜血管，而是快速將所有胎鼠皮層取下來，放到高糖培養(yǎng)基中。
3.剝離腦膜及血管應(yīng)全部分離干凈，否則在制作單細(xì)胞懸液時(shí)，會(huì)被迫加大吹打力量和次數(shù)，造成細(xì)胞損傷。
4.在培養(yǎng)過程中，為防止細(xì)胞貼壁分化，隔天輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)基。
5.避免細(xì)胞污染。加強(qiáng)無菌操作意識(shí)，做好實(shí)驗(yàn)室、實(shí)驗(yàn)器械等的消毒工
