elisa試劑盒實(shí)驗(yàn)中的注意事情

  異常

  結(jié)果描述

  原因分析

  對(duì)策

  白板

  顯色步驟結(jié)束后，酶標(biāo)板所有孔均無(wú)顏色。陽(yáng)性對(duì)照不顯色。

  試劑已過(guò)效期，或不同試劑盒組分混用

  檢查試劑的組分及批號(hào)，確認(rèn)未過(guò)期以及所有組分均屬對(duì)應(yīng)的試劑盒。不同試劑盒或不同批號(hào)的試劑不能混用。

  錯(cuò)加、漏加試劑底物、顯色劑A或B

  嚴(yán)格按說(shuō)明書的步驟操作，加完試劑后可觀察一下液面高度是否一致，以減少漏加現(xiàn)象。

  洗板及加樣過(guò)程中，酶標(biāo)受污染失活失去催化顯色劑顯色的能力

  確認(rèn)盛酶標(biāo)的容器不含酶抑制劑如疊氮鈉等，確認(rèn)配制洗液的容器已洗干凈。

  終止液誤作洗滌液稀釋或當(dāng)?shù)孜锞彌_液配制

  每次配制時(shí)都應(yīng)看清標(biāo)簽標(biāo)明物質(zhì)。

  蒸餾水有問題

  確認(rèn)配制洗液的純化水達(dá)到要求且未污染，與好蒸餾水比較。

  顯色弱、靈敏度低

  實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，包括陽(yáng)性對(duì)照、質(zhì)控在內(nèi)的所有板孔顏色均較淡。

  試劑盒超過(guò)期，超過(guò)有效期的產(chǎn)品可能會(huì)產(chǎn)生很弱的信號(hào);試劑盒沒有按規(guī)定進(jìn)行保存，受高溫影響;

  實(shí)驗(yàn)前檢查試劑的組分及批號(hào)，確認(rèn)試劑未過(guò)期。不要將試劑盒長(zhǎng)時(shí)間置于常溫下，按使用規(guī)定儲(chǔ)藏。

  試劑、樣品用前未平衡至室溫

  從低溫冰箱中取出的試劑及樣品應(yīng)置室溫平衡20分鐘左右。

  加入試劑的體積和時(shí)間有誤，移液器計(jì)量不準(zhǔn)，吸嘴內(nèi)水分太多或不清潔;

  確定所使用的試劑體積正確，加入時(shí)間適當(dāng)。校正移液器，移液器與吸嘴配合要緊密吻合。移液不宜太快，排放應(yīng)完全。

  洗板及加樣過(guò)程中，酶標(biāo)受污染失活而失去催化顯色劑顯色的能力;

  確認(rèn)盛酶標(biāo)的容器不含酶抑制劑如疊氮鈉等，確認(rèn)配制洗液的容器已洗干凈，確認(rèn)配制洗液的純化水達(dá)到要求且未受污染。

  孵育時(shí)間及孵育溫度未達(dá)到要求，反應(yīng)板放入培養(yǎng)箱時(shí)注意溫度并及時(shí)調(diào)整。

  孵育溫度應(yīng)控制在37-38℃，孵育時(shí)間嚴(yán)格按照說(shuō)明書操作。保溫期內(nèi)不宜多開門，以免影響保溫。

  洗板次數(shù)過(guò)多，或濃縮洗液稀釋倍數(shù)不符合要求;洗滌沖擊力太大。浸泡時(shí)間太長(zhǎng);

  嚴(yán)格按說(shuō)明書要求稀釋濃縮洗液及洗板，減小洗滌沖擊力，按說(shuō)明書要求置留洗滌液時(shí)間和洗滌次數(shù)。

  顯色劑加量不足或順序顛倒，或混合后加入;

  顯色劑滴瓶垂直向下，持力均勻，滴速不宜過(guò)快，先加顯色劑A，后加顯色劑B，不可將A、B液混合后加入。

  底物作用時(shí)間不夠;

  準(zhǔn)確定時(shí)。

  蒸餾水水質(zhì)有問題;

  測(cè)定蒸餾水配制試劑對(duì)酶免疫法的影響。

  實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，陰陽(yáng)性對(duì)照正常，質(zhì)控正常，但臨床標(biāo)本感覺顯色較弱

  待測(cè)標(biāo)本中可能不含強(qiáng)陽(yáng)性標(biāo)本，故結(jié)果可能是正常的

  如有懷疑，可復(fù)檢

  標(biāo)本加入疊氮鈉作為防腐劑

  酶免實(shí)驗(yàn)中的標(biāo)本禁用疊氮鈉作為防腐劑，可選用proclin、硫柳汞等其他防腐劑

  陰陽(yáng)性對(duì)照正常，但質(zhì)控、參考品或個(gè)別弱陽(yáng)性標(biāo)本未能檢出。

  未達(dá)要求的孵育溫度及孵育時(shí)間可檢出強(qiáng)陽(yáng)性標(biāo)本，但質(zhì)控或弱陽(yáng)性標(biāo)本受溫度變化影響較大而被未檢出。

  確認(rèn)孵育的溫度及孵育時(shí)間達(dá)到要求。

  質(zhì)控品或標(biāo)本高溫放置過(guò)久，或被反復(fù)凍融致待測(cè)物滴度下降，而未能檢出

  質(zhì)控品或標(biāo)本避免反復(fù)凍融。標(biāo)本在一周內(nèi)使用的，可存于2-8℃，如需長(zhǎng)期保存，應(yīng)置于-20℃以下保存。質(zhì)控品應(yīng)小量分裝，并置于-20℃以下保存。

  儀器設(shè)定不正確，濾光片不匹配。

  重新設(shè)定酶標(biāo)儀的參數(shù)，特別是檢查濾光片是否匹配。

  終止后，目測(cè)結(jié)果正常，但酶標(biāo)儀讀值結(jié)果偏低

  酶標(biāo)儀參數(shù)設(shè)定不正確。

  重新設(shè)定酶標(biāo)儀的參數(shù)，特別是檢查濾光片是否匹配。

  靈敏度過(guò)高、板底高、高背景

  終止后，整板結(jié)果顯現(xiàn)均一的黃色或淡黃色;或陰陽(yáng)性對(duì)照、質(zhì)控正常，標(biāo)本陰性標(biāo)本OD值過(guò)高。

  整板的黃板現(xiàn)象可能是由于錯(cuò)加其他試劑造成，如同時(shí)操作兩對(duì)半試劑時(shí)，測(cè)HbsAb板用于測(cè)HBsAg等;

  實(shí)驗(yàn)前檢查試劑的組分及批號(hào)，確認(rèn)所有組分均屬于對(duì)應(yīng)的試劑盒。不同試劑盒或不同批號(hào)的試劑不能混用。

  酶標(biāo)對(duì)吸頭的污染以及對(duì)盛放顯色劑容器的污染都易造成黃板現(xiàn)象;

  避免試劑組分間的交叉污染，確保吸頭、容器的干凈。

  顯色劑在光照條件下放置過(guò)久，實(shí)驗(yàn)前已變藍(lán)

  顯色劑A、B未使用前避光保存

  孵育溫度過(guò)高或孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng);

  孵育溫度應(yīng)控制在37-38℃，孵育時(shí)間嚴(yán)格按照說(shuō)明書操作。

  未按要求洗板。特別是洗滌時(shí)每孔未注滿洗液，易造成花板黃板現(xiàn)象

  嚴(yán)格按說(shuō)明書要求洗板。

  花板，一般是由于臨床標(biāo)本的收集、處理和保存方法不當(dāng)造成

  放置時(shí)間(自然放置1~2h)及離心轉(zhuǎn)速(3000r/min)、離心時(shí)間(15min)應(yīng)引起注意。

  出現(xiàn)隨機(jī)性的花板、跳孔現(xiàn)象

  樣品離心不完全，反應(yīng)孔內(nèi)發(fā)生凝血或殘留細(xì)胞成分;

  充分離心，3000rpm6分鐘以上。

  加樣時(shí)交叉污染;

  加標(biāo)本時(shí)盡量避免交叉污染。如盛標(biāo)本的試管周圍常有血痂，易脫落，應(yīng)遠(yuǎn)離酶標(biāo)板。

  手工洗板造成的交叉污染

  手工洗板時(shí)前3次注洗液后應(yīng)立即棄去，后幾次再設(shè)定浸泡時(shí)間，可減少交叉污染

  洗板機(jī)加液頭堵塞導(dǎo)致加液不滿或吸液殘留量較大，造成花板、跳孔

  疏通加液頭，使洗板時(shí)每孔均注滿洗液，吸液時(shí)殘留量要小。

  拍板時(shí)交叉污染

  洗板完畢拍板時(shí)用合適的吸水紙巾，不要把無(wú)關(guān)物質(zhì)拍進(jìn)板孔，并盡量不要在同位置拍，以免交叉污染。

  假陽(yáng)性

  假陽(yáng)性現(xiàn)象是一個(gè)綜合現(xiàn)象，可參考上文“靈敏度過(guò)高、板底高、高背景"中的分析。這里只列舉常見的原因及對(duì)策。

  計(jì)算Cutoff值時(shí)使用的公式不正確，導(dǎo)致計(jì)算得出的CutOff值過(guò)低，從而導(dǎo)致出現(xiàn)假陽(yáng)性

  CutOff值計(jì)算公式應(yīng)嚴(yán)格參照所屬產(chǎn)品的說(shuō)明書，應(yīng)注意各個(gè)酶免產(chǎn)品的Cutoff值計(jì)算公式不盡相同。

  洗板時(shí)未能注滿洗液或洗板次數(shù)、浸泡時(shí)間不夠，洗滌不充分，樣品中有其他成分殘留導(dǎo)致花板、跳孔，假陽(yáng)性增多

  嚴(yán)格按說(shuō)明書要求洗板。調(diào)整洗板機(jī)時(shí)，應(yīng)注意有時(shí)儀器標(biāo)示的液量與實(shí)際液量并不相符，應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整至每孔注滿。

  血清標(biāo)本處理不當(dāng)，如未除去細(xì)胞成分、纖維蛋白原及其它干擾物可出現(xiàn)孔底由變藍(lán)的跳孔現(xiàn)象，此標(biāo)本重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果往往是陰性;

  放置時(shí)間(自然放置1~2h)及離心轉(zhuǎn)速(3000r/min)、離心時(shí)間(15min)應(yīng)引起注意。

  廠家試劑質(zhì)量的變化造成;

  國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求提高靈敏度時(shí)，廠家試劑靈敏度也相應(yīng)提高，假陽(yáng)率常常有所上升，但只要在合理范圍，是可以接受的。

  水質(zhì)問題;

  防止蒸餾水污染。

  加酶量過(guò)多(如50uL誤認(rèn)為100uL)或丙肝酶稀釋時(shí)加量過(guò)多;

  加酶前檢查移液器調(diào)節(jié)量是否準(zhǔn)確，稀釋酶時(shí)思想要集中。

  培養(yǎng)箱溫度超過(guò)37℃或酶結(jié)合物反應(yīng)時(shí)間或底物顯色時(shí)間超過(guò);

  放入板以前要檢查培養(yǎng)箱的溫度，準(zhǔn)確定時(shí)。

  底物配制時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、或底物污染;

  底物應(yīng)在酶反應(yīng)完畢即將洗滌前5分鐘配制，注意避光。

  該批樣品放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，樣品污染;

  樣品應(yīng)保持新鮮，或低溫保存，防止污染。

  移液嘴重復(fù)使用，未洗凈或消毒不完全而用于加酶或底物;

  移液嘴盡可能一次性使用。

  重復(fù)性差

  1、樣品數(shù)量不一，加樣時(shí)間長(zhǎng)短不一;

  重復(fù)某一樣品時(shí)，加樣時(shí)間盡可能與次接近。

  2、樣品加入后未混勻;

  加樣后在混勻器上充分混勻。

  3、酶標(biāo)儀濾光片不對(duì)或輸入波長(zhǎng)不對(duì);

  TMB顯色用450/630波長(zhǎng).

  4、酶標(biāo)儀測(cè)定重復(fù)性差;

  校對(duì)酶標(biāo)儀。

  5、洗滌不正確;

  洗滌液注滿各孔但不要溢出。洗板時(shí)反應(yīng)板面向下，垂直用力甩凈內(nèi)容物(可多甩幾次)，在干凈、無(wú)或少塵的吸水材料上拍干。洗板機(jī)洗板時(shí)不應(yīng)有堵孔，洗滌應(yīng)充分。

  6、溫育條件不一致(一次用水育，一次用恒溫箱)

  恒溫箱溫育較水浴顯色深，OD值高出0.1-0.15,好均采用恒溫箱.如用水浴水溫應(yīng)控制在37℃。

  7、不慎多加或少加酶或顯色劑;

  多加時(shí)顯色深，少加則淺，用記號(hào)筆圈上，便于分析。

  8、閾值附近時(shí)陰時(shí)陽(yáng);

  同一樣品做三個(gè)復(fù)孔，以二個(gè)(含二個(gè)以上相同結(jié)果為準(zhǔn))

  9、加樣量不足、保溫時(shí)間、洗滌條件一致;

  盡可能使用同一移液器和裝緊吸嘴重復(fù)測(cè)定標(biāo)本。條件、人員等應(yīng)盡量與上次保持一致。

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