課堂小知識：免疫熒光染色及注意事項

  免疫熒光染色：

  (1)冰凍切片用0. 01 moUL PBST(或PBS)漂洗或沖洗3次，每次5min。

  (2) 3% H2O2孵育10min，再用0. 01 mol/L PBS沖洗3次，每次5 min。

  (3) 5%一8%的正常動物血清(山羊或馬血清)孵育30-60min。

  (4)洗掉血清，滴加一抗(0. 01 mol/L PBS配制)，4℃過夜。

  (5)吸出一抗，0. 01 mol/L PBS沖洗3次，每次5 min，加入熒光標記的二抗(0. 01 mol/L PBS配制)，4℃過夜。

  (6)吸出二抗，0. 01 mol/L PBS沖洗3次，每次 10min。

  (7)封片劑封片，熒光顯微鏡觀察照相。

  注意事項：

  (1) 由于熒光容易淬滅，一般僅能維持幾個小時，因此，熒光二抗應避光保存，即從加入熒光二抗以后的步驟中都要盡量避光操作。封片后應盡早照相，目前有市售的熒光增強劑，可使熒光在4℃保存1-2周仍不淬滅。

  (2) 常用的熒光素有以下幾種，綠色熒光：FITC、 Alexa Fluor 488和GFP;紅色熒光：TRITC、Cy3、Alexa Fluor 568&594和MitoTrackerRed;藍色熒光：Hoechst、DAPI;黃色熒光：YFP、Fluo-3和Rhoda-minel23等。

  (3)不同的熒光素激發的波長不同，因此，選用濾光片時要注意。一般紫外線的激發波長為334-365nm，藍光的激發波長為435-490nm，綠光的激發波長為546nm左右。

  (4) 熒光顯微鏡應提前至少15 min打開汞燈預熱。關閉30min后方可再開啟。

  (5)免疫熒光的組織要求很高，載玻片及蓋玻片要干凈無雜質。進行熒光染色時，需注意染液的pH、濃度和染色溫度，還要避免對熒光有熄滅作用的物質的接觸。組織和細胞也有自發熒光，如紅細胞中的血紅蛋白呈紅色熒光，維生素A呈綠色自發性熒光等。

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