瓊脂糖凝膠電泳注意事項及操作流程

  凝膠電泳操作注意事項：

  1. 緩沖系統(tǒng)：在沒有離子存在時，電導率小，DNA不遷移，或遷移極慢，在高離子強度的緩沖液中，電導很高并產(chǎn)熱，可能導致DNA變性，因此應(yīng)注意緩沖液的使用是否正確。長時間高壓電泳時，常新緩沖液或在兩槽間進行緩沖液的循環(huán)是可取的。

  2. 瓊脂糖：不同廠家、不同批號的瓊脂糖，其雜質(zhì)含量不同，影響DNA的遷移及熒光背景的強度，應(yīng)有選擇地使用。

  3. 凝膠的制備：凝膠中所加緩沖液應(yīng)與電泳槽中的相一致，溶解的凝膠應(yīng)及時倒入板中，避免倒入前凝固結(jié)塊。倒入板中的凝膠應(yīng)避免出現(xiàn)氣泡，影響電泳結(jié)果。

  4. 樣品加入量：一般情況下，0.5cm寬的梳子可加0.5ug的DNA量，加樣量的多少依據(jù)加樣孔的大小及DNA中片段的數(shù)量和大小而定，過多的量會造成加樣孔超載，從而導致拖尾和彌散，對于較大的DNA此現(xiàn)象明顯。

  5. 電泳系統(tǒng)的變化會影響DNA的遷移，加入DNA標準參照物進行判定是必要的。

  6. DNA樣品中鹽濃度會影響DNA的遷移率，平行對照樣品應(yīng)使用同樣的緩沖條件以消除這種影響。

  7. DNA遷移率取決于瓊脂糖凝膠的濃度，遷移分子的形狀及大小。采用不同濃度的凝膠有可能分辨范圍廣泛的DNA分子，制備瓊脂糖凝膠可根據(jù)DNA分子的范圍來決定凝膠的濃度。小片段的DNA電泳應(yīng)采用聚丙烯酰胺凝膠電泳以提高分辨率。

  瓊脂糖加樣時候注意事項：

  1、 用移液搶將樣品加至點樣孔。每孔點樣的體積一般少于25ul，因此吸取每一個樣品時，操作要穩(wěn)當且細心。

  2、 常加一定量的蔗糖來增加樣品的濃度，以使每個樣品停留在各自的點樣孔中。

  3、 在樣品中加入水溶性的陰離子追蹤染料(如溴酚藍)，用以看出樣品移動的距離。

  4、 在一個或幾個孔中加入標準分子質(zhì)量樣品，電泳結(jié)束后，根據(jù)已知分子質(zhì)量的帶的相應(yīng)位置可用來做出標準曲線。

  5、 電泳一般是在追蹤染料泳動到膠的80%部位時停止。注意電泳期間，電泳槽蓋要安全蓋好，以防止液體蒸發(fā)，又可以降低電擊的可能性。

  6、 電泳結(jié)束后，將膠浸沒在1mg/L的溴化乙錠(EB)中，5min后即可看到DNA帶，EB通過插入在雙螺旋的配對核苷酸之間同NDA結(jié)合。另一種方法是電泳時，在膠中加入EB。

  7、 在紫外燈下，由于EB發(fā)出強烈的橘紅色的熒光，所以可以看到DNA帶。利用這種方法檢測的界限是每條帶約10ng DNA。帶上塑料安全眼鏡可防止紫外光對眼睛的傷害。可用尺子來測量每條帶至點樣孔的距離。同樣，利用特制的照相機和調(diào)焦器，也可以對凝膠拍照。

  8、 如果要對某一條帶(如質(zhì)粒)進一步分析，可用小刀將含該帶的凝膠切割下來，從帶中回收DNA。

  瓊脂糖核酸電泳實驗操作流程

  1.用蒸餾水將制膠模具和梳子沖洗干凈，放在制膠平板上，封閉模具邊緣，架好梳子;

  2.根據(jù)欲分離DNA片段大小用凝膠緩沖液配制適宜濃度的瓊脂糖凝膠：準確稱量瓊脂糖干粉，加入到配膠用的三角燒瓶內(nèi)，定量加入電泳緩沖液(一般20~30 ml);

  3.放入到微波爐內(nèi)加熱熔化。冷卻片刻，加入一滴熒光染料，輕輕旋轉(zhuǎn)以充分混勻凝膠溶液，倒入電泳槽中，待其凝固;

  4.室溫下30~45分鐘后凝膠*凝結(jié)，小心拔出梳子，將凝膠安放在電泳槽內(nèi);

  5.向電泳槽中倒入電泳緩沖液，其量以沒過膠面1mm為宜，如樣品孔內(nèi)有氣泡，應(yīng)設(shè)法除去;

  6.在DNA樣品中加入10×體積的載樣緩沖液(loading buffer)，混勻后，用槍將樣品混合液緩慢加入被浸沒的凝膠加樣孔內(nèi);

  7.接通電源，紅色為正極，黑色為負極，切記DNA樣品由負極往正極泳動 (靠近加樣孔的一端為負)。一般60～100V電壓，電泳20～40min即可;

  8. 根據(jù)指示劑泳動的位置，判斷是否終止電泳;

  9.電泳完畢，關(guān)上電源，在凝膠成像儀上觀察電泳帶及其位置，并與核酸分子量標準Marker比較被擴增產(chǎn)物的大小。

  瓊脂糖凝膠濃度與線形DNA的jia分辨范圍

  0.5%1,000～30,000

  0.7%800～12,000

  1.0%500～10,000

  1.2%400～7,000

  1.5%200～3,000

  2.0%50～2,000

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