免疫熒光雙標技術HE染色的原理

  免疫熒光雙標技術稱HE染色原理，根據易于被堿性或酸性染料著色的性質稱為嗜堿性( basophilia )和嗜酸性( acidophilia );而對堿性染料和酸性染料親和力都比較弱的現象稱為中性(neutrophilia)。構成組織內蛋白質的氨基酸的種類很多，它們有不同的等電點。在普通染色法中，染色液的酸堿度為pH6左右，細胞內的酸性物質如細胞核的染色質、腺細胞和神經細胞內的粗面內質網及透明軟骨基質等均被堿性染料染色，這些物質稱為嗜堿性。

  免疫熒光雙標技術而細胞質中的其它蛋白質如紅細胞中的血紅蛋白、嗜酸粒細胞的顆粒及膠原纖維和肌纖維等被酸性染料染色，這些物質稱為嗜酸型。如果改變染色液的酸堿度，pH值升高時，則原來被酸性染料染色的物質可變為嗜堿性;pH值降低時，原來被堿性染料染色的物質則可變為嗜酸性。

  免疫熒光雙標技術所以說染色液的pH值可以影響染色的反應。脫氧核糖核酸(DNA)兩條鏈上的磷酸基向外，帶負電荷，呈酸性，很容易與帶正電荷的蘇木精堿性染料以離子鍵結合而被染色。蘇木精在堿性溶液中呈藍色，所以細胞核被染成藍色。

  免疫熒光染色需要注意的知識：

  (1)古朵生物提醒：由于熒光容易淬滅，一般僅能維持幾個小時，因此，熒光二抗應避光保存，即從加入熒光二抗以后的步驟中都要盡量避光操作。封片后應盡早照相，目前有市售的熒光增強劑，可使熒光在4℃保存1-2周仍不淬滅。

  (2) 免疫熒光染色常用的熒光素有以下幾種，綠色熒光：FITC、 Alexa Fluor 488和GFP;紅色熒光：TRITC、Cy3、Alexa Fluor 568&594和MitoTrackerRed;藍色熒光：Hoechst、DAPI;黃色熒光：YFP、Fluo-3和Rhoda-minel23等。

  (3)陜西依科生物提醒，不同的熒光素激發的波長不同，因此，選用濾光片時要注意。一般紫外線的激發波長為334-365nm，藍光的激發波長為435-490nm，綠光的激發波長為546nm左右。

  (4) 熒光顯微鏡應提前至少15min打開汞燈預熱。關閉30min后方可再開啟。

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