名稱：四環素快速檢測試劑盒
供應商：古朵生物
產地：國產|進口
檢測樣本：組織/血清/蜂蜜/牛奶/雞蛋/飼料/尿液
檢測方法： 酶聯免疫法
檢測限： 0.1ppb/0.05ppb
產品規格：96T×1/盒
保質期：12個月
儲藏：于2～8℃避光保存。

四環素快速檢測試劑盒實驗步驟  產品概要：

1 原理及用途
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測組織、蜂蜜、雞蛋等樣本中的四環素類藥物（Tetracyclines，Tc），試劑盒由預包被偶聯抗原的酶標板、辣根酶標記物、抗體、標準品及其他配套試劑組成。檢測時，加入標準品或樣品溶液，樣本中的四環素類藥物和酶標板上預包被偶聯抗原競爭抗四環素類藥物抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含四環素類藥物含量成負相關，與標準曲線比較即可得出樣本中四環素類藥物的殘留量。

2 技術指標
2.1 試劑盒靈敏度：0.05ppb(ng/ml)
2.2 反應模式：37℃，30min～30min～15min。

3 試劑盒組成
酶標板96孔
標準品（黑蓋）：各1ml
0ppb、0.5ppb、1.5ppb、4.5ppb、13.5ppb、40.5ppb
高標準品（黑蓋）：1ppm1ml
酶標記物 (紅蓋)12ml
抗體工作液 (藍蓋)7ml
底物液A(白蓋)7ml
底物液B(黑蓋)7ml
終止液(黃蓋)7ml
20X濃縮洗滌液(透明蓋)40 ml
5X復溶液(黃蓋)50 ml
說明書 1份

4 需要的器材和試劑
4.1 儀器：酶標儀、打印機、均質器 、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）
4.2 微量移液器：單道20μl-200μl，100μl-1000μl、多道300μl
4.3 試劑：三氯yi酸、甲醇

5 樣本前處理
5.1 樣本處理前須知：
    實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭。實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必須使用潔凈實驗器具，以避免污染干擾實驗結果。
5.2 配液：
配液1：復溶液
    用去離子水將5×濃縮復溶液按1：4稀釋（1份濃縮復溶液+4份去離子水）用于樣本復溶。
配液2：1%三氯yi酸溶液
    稱取1g三氯yi酸加去離子水100ml溶解。
5.3 樣本前處理步驟：
5.3.1 組織、肝臟、雞蛋樣本處理方法（不用過柱）
1）用均質器均質組織、肝臟、雞蛋樣本；
2）稱取2±0.05g樣本于50ml離心管中，加入6ml 1%三氯yi酸溶液，振蕩2min，室溫4000r/min以上，離心10min；
3）取出1ml上清液于另一試管中，加入1m甲醇，振蕩1min，室溫4000r/min以上，離心10min；
4）取1ml上清液在50-60℃氮氣或空氣吹干，加入1ml復溶液溶解殘留的干燥物；
5）取50 μl用于分析。  樣本稀釋倍數：6
5.3.2 蜂蜜樣本處理方法
1）準確稱取1±0.05g蜂蜜樣本于離心管中，加入2ml 1%三氯yi酸，振蕩2min，室溫4000r/min以上，離心10min；
2）取出100ul上清液于另一試管中，加入1900ul復溶液稀釋，混合30s；
3）取50μl用于分析。  樣本稀釋倍數：40

6 酶聯免疫試驗步驟
將所需試劑從4℃冷藏環境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時可能會有結晶需恢復到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。
實驗開始前需：
將20×濃縮洗滌液用去離子水按1:19稀釋成工作洗滌液。
制備四環素標準應用液：將各濃度標準品分別用稀釋好的復溶液10倍稀釋成應用液，現配 現用。（如：分別取50ul各濃度標準品加450ul稀釋好的復溶液，混合均勻，即成各濃度標準品的應用液。）
6.1 編    號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。
6.2 加樣反應：加標準品或樣本50μl/孔到各自的微孔中，然后加抗體工作液50μl/孔，用蓋板膜封板，輕輕振蕩5秒混勻，37℃反應30分鐘。
6.3 洗    滌：小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，用工作洗滌液250μl/孔充分洗滌5次，每次間隔30秒，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
6.4 加酶反應：每孔加入酶標記物100μl，蓋板膜蓋板后置37℃
環境中反應30min。
6.5 洗    滌：同7.3
6.6 顯    色：每孔加入底物液A 50μl，再加底物液B 50μl，輕輕振蕩5秒混勻，37℃避光顯色15分鐘。
6.7 終    止：每孔加入終止液50μl，輕輕振蕩混勻，終止反應。
6.8 測吸光值：用酶標儀于450nm處測定每孔吸光度值（建議用雙波長450/630nm）。測定應終止反應后在10分鐘內完成。

7 結果分析
7.1 百分吸光率的計算
    標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第1個標準（0ppb）的吸光度值，再乘
以，即
 百分吸光度值（%）＝    A    ×
    A0    
A—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值
A0—0ppb標準溶液的平均吸光度值
7.2 標準曲線的繪制與計算
以標準品百分吸光率為縱坐標，對應的標準品濃度（ppb）的對數為橫坐標，繪制標準品的半對數曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中待測物的實際濃度。
若利用試劑盒專業分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。

注意事項：
實驗前請閱讀以下文字，以保證獲得jia實驗效果。
標準品中含有赭曲du素A，請小心使用。
不要使用過期的試劑盒。
不同批次的試劑盒不要混用，抗體和微孔板具有盒與批次的特異性。
盡量保持室溫（22.5±2.5）°C，避免在通風口操作防止溫度過低，過熱和/或者蒸發。同樣的，不要在陽光直射下實驗，防止過熱及蒸發。在孵育期間，如果工作臺溫度過低，應該鋪墊若干紙巾或者其他物料。
水質量很重要，確保使用蒸餾或者去離子水。
加入樣品或者試劑到空的微孔板時，吸嘴靠于微孔接近底部，并保持接觸。
孵育時間的計算越規范越好，保持添加標準品的一致性，先添加標準品后添加樣品。
從低濃度到高濃度地添加標準品，降低影響標準品曲線質量的風險。
將微孔板置于放有干燥劑的密封袋中，冷藏保存。
確保洗板正確，洗板充分。
樣品的準備
確保樣品的正確保存，一般來說，樣品在2-4只能保存1-2天，如果要保存更長時間，就要保存在-20冷凍保存，在用之前需要將冷凍的樣品在室溫下或冰箱內解凍。

試劑的準備：
所有的試劑在使用之前應將其回溫至室溫，并在使用試劑前搖動幾下，以保證合理的濃度。
（1）1×工作洗液按1：19的比例配制濃縮洗液和蒸餾水。舉例：取10ml的20X濃縮洗液加入到190ml雙蒸餾水中，配制成200ml的1X工作洗液，按需要，可同比例放大或縮小。
（2）70%甲醇按70：30的比例配制無水甲醇和蒸餾水，舉例：取70ml無水甲醇加入到30ml蒸餾水中，配制成100ml的70%甲醇，按需要，可同比例放大或縮小。
（3）35%甲醇按35：65的比例配制無水甲醇和蒸餾水，舉例：取35ml無水甲醇加入到65ml蒸餾水中，配制成100ml的35%甲醇，按需要，可同比例放大或縮小。

注意：試劑在使用之前要在室溫下解凍1-2小時，確定在使用前閱讀過注意事項。準備適量的檢測用試劑，所有的試劑搖勻后使用。準備足夠所有小管所需的用量，不能將試劑倒回原來的瓶子中，處理試劑時建議用廢棄的瓶子以降低污染的風險。
 
【操作注意事項】
1.實驗操作時需戴手套、穿工作衣，嚴格健全和執行消毒隔離制度，各種實驗廢棄物都應按傳染物處理。
2.終止液具有腐蝕性，應避免接觸皮膚和衣物，如不慎接觸請立即用大量自來水沖洗。
3.微孔板從冷藏環境中取出時應恢復至室溫方可開袋，未用完的微孔板需放入有干燥劑的密封袋中保存(包被板開封后請于2～8℃避光保存，使用期限為1個月)。
4.濃縮洗滌液在低溫時容易結晶，使用時需恢復至室溫以完全溶解。
5.洗滌時各孔均需加滿液體，防止孔口有游離酶不能洗凈。
6.用于檢測的樣品應保持新鮮。
7.試驗結果的判定必須以酶標儀讀數為準。
8.不同批號試劑組分不得混用。

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