RT-01011 鏈cDNA合成試劑盒
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產品名稱：RT-01011 鏈cDNA合成試劑盒
產品型號：RT-01011
產品廠商：上海古朵生物科技有限公司
簡單介紹
產品名稱:鏈cDNA合成試劑盒英文名稱:RT EasyTM（For first-strand cDNA synthesis）產品規格:25 rxns 100 rxns產品貨號:RT-01011保存說明:短期室溫，長期2-8℃產品描述:用于長cDNA合成或者客戶特定引物RT反應
RT-01011 鏈cDNA合成試劑盒的詳細介紹
產品名稱:鏈cDNA合成試劑盒
英文名稱:RT EasyTM（For first-strand cDNA synthesis）
產品規格:25 rxns 100 rxns
產品貨號:RT-01011
保存說明:短期室溫，長期2-8℃
產品描述:用于長cDNA合成或者客戶特定引物RT反應
英文名稱:RT EasyTM（First-strand cDNA for Real Time PCR）
產品規格:50 rxns 200 rxns
產品貨號:RT-01021
產品描述:鏈合成，添加2種引物，用于Real Time PCR
鏈cDNA合成試劑盒 注意事項:
1、確保RNA完整性及純度。RNA質量是決定合成cDNA鏈成功的關鍵因素,其純度及完整性可由OD260/OD280比值和進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。較純的RNA樣品OD260/OD280比值通常為1.8-2.0,若該比值偏低,應進一步純化。真核生物RNA樣品電泳圖譜28s和18s的比值約為2:1,否則,表明有RNA降解。
2、避免RNA酶污染。進行cDNA合成所用的器皿、試劑和溶液必須完全無菌。操作過程始終戴手套以杜各種RNA酶的污染。
3、?合成cDNA鏈的引物選擇。選擇oligo(dT)12-18作為反轉錄引物,可保證cDNA具有完整的3’-端,通常可得到接近全長的cDNA鏈;若選擇隨機寡核苷酸(dN)6或(dN)9作為引物,引物在整個mRNA的多個位點退火,產生短的部分長度的cDNA鏈。這種方法經常用于獲得5’末端序列及從帶有二級結構區域或帶有逆轉錄酶不能復制的終止位點的RNA模板獲得cDNA。
鏈cDNA合成試劑盒 操作方法:
1、?逆轉錄反應
(1)?在無菌薄壁管中加入以下成份:
Total?RNA 0.5-1.0μg
(dN)9?or?oligo(dT)18 100pmol
(2)?混勻后,70℃變性5min,將薄壁管迅速置于冰上冷卻,然后依次加入以下成份:
5×M-MLV?Buffer?????4μl
dNTPs(10mM?each)????1μl
RNasin????????10U
100mM?DTT???????2μl
M-MLV?Reverse?Trans
DEPC-treated?water????up?to?20μl
（3）?混勻后短暫離心，使用oligo(dT)18引物時在42℃，使用隨機引物(dN)9時在37℃下溫育1小時。
(4)?94℃?5min終止反應后,冰上冷卻。
(5)?合成的cDNA鏈可直接用于PCR擴增或進行其它下游操作。
2、?PCR擴增
(1)?在PCR薄壁管中加入以下試劑
Synthesized?cDNA????2-5μl
10×PCR?Buffer?????2μl
Upper?primer?????10pmol
Lower?primer?????10pmol
dNTPs(10mM?each)????0.5μl
Taq?DNA?Polymerase????1.5U
ddH2O???????up?to?20μl
(2)?混勻后短暫離心,然后進行PCR擴增。
94℃預變性2.5min。進入下列30~40個循環(此擴增條件僅供參考):94℃30s,60℃?45s,72℃?1min~3min。后72℃延伸7min。
鏈cDNA合成試劑盒 常見問題及參考意見
1、cDNA產量很低,為什么?
可能的原因：(1)RNA模板質量低；(2)對mRNA濃度估計過高；(3)反應體系中存在反轉錄酶抑制劑或反轉錄酶量不足；(4)反應體積過大，一般不應超過50μl。
2、合成不了長鏈的cDNA,為什么?
(1)?RNA降解。對使用的器具、試劑用DEPC、干熱或濕熱滅菌處理，以杜RNase污染。同時，在逆轉錄反應中加入RNase抑制劑。
(2)?反應條件不合適。通過預實驗確定合適的反應條件，包括酶量、鹽濃度、反應溫度（37~56℃）、DTT濃度（0.5~10mM）。
(3)?RNA結構問題。提高逆轉錄反應溫度，或者使用隨機引物。
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英文名稱:RT EasyTM（For first-strand cDNA synthesis）
產品規格:25 rxns 100 rxns
產品貨號:RT-01011
保存說明:短期室溫，長期2-8℃
產品描述:用于長cDNA合成或者客戶特定引物RT反應
英文名稱:RT EasyTM（First-strand cDNA for Real Time PCR）
產品規格:50 rxns 200 rxns
產品貨號:RT-01021
產品描述:鏈合成，添加2種引物，用于Real Time PCR
1、確保RNA完整性及純度。RNA質量是決定合成cDNA鏈成功的關鍵因素,其純度及完整性可由OD260/OD280比值和進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。較純的RNA樣品OD260/OD280比值通常為1.8-2.0,若該比值偏低,應進一步純化。真核生物RNA樣品電泳圖譜28s和18s的比值約為2:1,否則,表明有RNA降解。
2、避免RNA酶污染。進行cDNA合成所用的器皿、試劑和溶液必須完全無菌。操作過程始終戴手套以杜各種RNA酶的污染。
3、?合成cDNA鏈的引物選擇。選擇oligo(dT)12-18作為反轉錄引物,可保證cDNA具有完整的3’-端,通常可得到接近全長的cDNA鏈;若選擇隨機寡核苷酸(dN)6或(dN)9作為引物,引物在整個mRNA的多個位點退火,產生短的部分長度的cDNA鏈。這種方法經常用于獲得5’末端序列及從帶有二級結構區域或帶有逆轉錄酶不能復制的終止位點的RNA模板獲得cDNA。
鏈cDNA合成試劑盒 操作方法:
1、?逆轉錄反應
(1)?在無菌薄壁管中加入以下成份:
Total?RNA 0.5-1.0μg
(dN)9?or?oligo(dT)18 100pmol
(2)?混勻后,70℃變性5min,將薄壁管迅速置于冰上冷卻,然后依次加入以下成份:
5×M-MLV?Buffer?????4μl
dNTPs(10mM?each)????1μl
RNasin????????10U
100mM?DTT???????2μl
M-MLV?Reverse?Trans
DEPC-treated?water????up?to?20μl
（3）?混勻后短暫離心，使用oligo(dT)18引物時在42℃，使用隨機引物(dN)9時在37℃下溫育1小時。
(4)?94℃?5min終止反應后,冰上冷卻。
(5)?合成的cDNA鏈可直接用于PCR擴增或進行其它下游操作。
2、?PCR擴增
(1)?在PCR薄壁管中加入以下試劑
Synthesized?cDNA????2-5μl
10×PCR?Buffer?????2μl
Upper?primer?????10pmol
Lower?primer?????10pmol
dNTPs(10mM?each)????0.5μl
Taq?DNA?Polymerase????1.5U
ddH2O???????up?to?20μl
(2)?混勻后短暫離心,然后進行PCR擴增。
94℃預變性2.5min。進入下列30~40個循環(此擴增條件僅供參考):94℃30s,60℃?45s,72℃?1min~3min。后72℃延伸7min。
鏈cDNA合成試劑盒 常見問題及參考意見
1、cDNA產量很低,為什么?
可能的原因：(1)RNA模板質量低；(2)對mRNA濃度估計過高；(3)反應體系中存在反轉錄酶抑制劑或反轉錄酶量不足；(4)反應體積過大，一般不應超過50μl。
2、合成不了長鏈的cDNA,為什么?
(1)?RNA降解。對使用的器具、試劑用DEPC、干熱或濕熱滅菌處理，以杜RNase污染。同時，在逆轉錄反應中加入RNase抑制劑。
(2)?反應條件不合適。通過預實驗確定合適的反應條件，包括酶量、鹽濃度、反應溫度（37~56℃）、DTT濃度（0.5~10mM）。
(3)?RNA結構問題。提高逆轉錄反應溫度，或者使用隨機引物。
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